Ma `lumot

6.4: E. colida replikatsiya landshafti - Biologiya


6.4: E. colida replikatsiya landshafti

DNK replikatsiyasi va bo'linish sikli Escherichia coli *

Sinxron bo'linishni fiziologik jihatdan normal madaniyatlarda olish mumkin Escherichia coli, Helmstetter-Cummings texnikasi bilan B/r shtammi. DNK sintezining tezligi hujayralar yoshiga bog'liq bo'lib, glyukoza-minimal muhitda har bir bo'linish siklining yarmigacha ikki baravar ko'payadi. Bosqichlar orasidagi tezlik doimiy bo'lib qoladi. Bundan tashqari, turli yoshdagi hujayralarning xloramfenikol ishtirokida DNKni sintez qilish qobiliyati aniqlangan. Ushbu tajribalar shuni ko'rsatadiki, replikatsiyaning yangi bosqichi DNK sintezining umumiy tezligi ikki baravar ko'paygan vaqtda, ya'ni hujayra bo'linishidan 20-25 daqiqa oldin boshlanadi. Biz shunday xulosaga keldikki, ma'lum bir sintez joyida replikatsiya tezligi ushbu o'sish sharoitida doimiy bo'ladi va sintez tezligining o'lchangan ikki barobari saytlar sonining ikki barobar ko'payishini aks ettiradi.

Glitserin yoki suksinat muhitidagi kulturalar va uch xil Hfr shtammlarining glyukoza kulturalari bilan o'tkazilgan shunga o'xshash tajribalar shuni ko'rsatadiki, replikatsiya boshlanishi va hujayra bo'linishi o'rtasidagi vaqt o'sish tezligi va genetik transferning kelib chiqishiga bog'liq emas.

Ushbu tadqiqot qisman Allergiya va yuqumli kasalliklar milliy institutidan AI 04914-04 Davlat sog'liqni saqlash xizmati tadqiqot granti, Milliy umumiy tibbiyot institutidan GM 12524 va 7-FE-GM-10, 118-03 doktorlik stipendiyasi tomonidan qo'llab-quvvatlandi. .


Impuls bilan belgilangan DNK molekulalarining strukturaviy tahlili

Bir yondashuv yangi sintez qilingan DNKni qisqa vaqt davomida DNK molekulalarining asinxron populyatsiyasida belgilashdir (deb ataladi). impulslarni belgilash ), izolyatsiya qiling yakunlandi DNK molekulalari va keyin radioaktiv yorliqning ko'rinishini, xususan, cheklash fragmentlarini kuzatib boring. Molekulalar sinxron replikatsiya qilinmaganligi sababli, DNK molekulalarining ba'zilari qisqa impuls yorlig'i paytida tugaydi, boshqalari esa radio yorlig'ini o'z ichiga oladi. 6.2-rasmda ko'rsatilganidek, qisqa impuls belgisi davomida replikatsiyani tugatgan DNK molekulalari replikatsiya yakunini o'z ichiga olgan cheklash fragmentida radioaktiv yorliqga ega bo'ladi. Replikatsiya qiluvchi molekulalar uzoqroq vaqt davomida (puls uzoqroq) etiketlangan bo'lsa, tugallangan DNK molekulalari nafaqat terminalni o'z ichiga olgan cheklash bo'laklarida, balki qo'shni bo'laklarda ham radioaktiv belgiga ega bo'ladi. Replikatsiyaning kelib chiqishi faqat impuls vaqti DNK molekulasining to'liq sintezi uchun zarur bo'lgan vaqtgacha uzaytirilishi bilan belgilanadi. Shunday qilib, ushbu protsedurada asinxron replikatsiyalanuvchi molekulalar bir qator uzunlikdagi impuls davrlari uchun belgilansa va tugallangan DNK molekulalari har bir impuls oxirida tekshirilganda, replikatsiyaning oxiri eng erta vaqt nuqtalarida, o'z ichiga olgan molekulalar esa eng erta vaqt nuqtalarida belgilanadi. kelib chiqishi oxirgi bo'ladi.

6.2-rasm. Sintezning turli vaqtlarida impuls bilan belgilangan qiz DNK molekulalarida radioaktivlikning tarqalishi. Yupqa qora gorizontal chiziqlar tugallanishning turli bosqichlarida DNK molekulalarini ko'paytiruvchi etiketlanmagan. Kelib chiqishi (ori) chapda, oxiri (termin) o'ngda. Qalin kulrang chiziqlar replikatsiya qiluvchi DNK molekulalarining radioaktiv yorliqli qismlaridir. 5 daqiqalik impulsdan so'ng, 0 vaqtida ko'rsatilgan DNK molekulalarining bir qismi sintezni yakunladi. Ular vertikal chiziqlar bilan belgilangan joylarda cheklovchi endonukleaz bilan to'planadi, hazm qilinadi. E'tibor bering, replikatsiya yakunini o'z ichiga olgan cheklash fragmentlari qisqa pulsdan keyin radioaktiv belgiga ega bo'ladi. Uchinchi panelda uzoqroq impulslarni belgilash davrining natijalari ko'rsatilgan. Sintezni yakunlash uchun radioaktiv yorliq qo'shilgandan keyin sintezni boshlagan molekulalar uchun etiketkalash vaqti etarlicha uzoq bo'ldi. Ushbu oxirgi molekulalar kelib chiqishini o'z ichiga olgan cheklash bo'laklarida yorliqga ega bo'ladi. Shunday qilib, ushbu protokolda yorliq faqat uzoqroq impuls davrlarida kelib chiqishini o'z ichiga olgan cheklash bo'laklarida paydo bo'ladi.

Bu kontseptsiya Dintzis tomonidan 1960-yillarning o'rtalarida oqsil sintezi yo'nalishini o'lchash uchun qo'llangan yondashuvdan kelib chiqqan (uchinchi qismdagi V bobga qarang). Bu chalkash bo'lishi mumkin, shuning uchun o'xshashlikni sinab ko'raylik. Tasavvur qiling-a, 20 nafar talaba qora harflardan foydalanadigan matn protsessorlari yordamida insho yozmoqda. Ularning barchasi o'z maqolalarini to'ldirishning turli bosqichlarida va ular insholarini qayta ko'rib chiqmaydilar yoki tahrirlamaydilar - ularni boshidan oxirigacha yozadilar. Belgilangan vaqtda barcha so'z protsessorlari qizil harflardan foydalanishga o'tkaziladi. Har bir talaba qog'ozini to'ldirganda, ularni chop etadi va topshiradi. Shrift rangi o'zgartirilganda deyarli tugatilgan talabalarning insholari oxirida faqat qizil matn bo'ladi. Rang o‘zgartirilganda inshoning yarmiga yetgan talabalarning insholari oxirgi yarmida qizil matnga ega bo‘ladi. Harf rangi o'zgarganda insho yozishni endigina boshlagan talabalarning boshida, shu jumladan qizil matn bo'ladi. Harflarning qizil rangga o'tishi radioaktivlik bilan DNK molekulalarining puls belgilariga o'xshaydi. Rang o'zgarishidan ko'p o'tmay tugallangan insholar oxirida qizil rangga ega bo'lgani kabi, qisqa impuls yorlig'i davomida replikatsiyani tugatgan DNK molekulalarining oxirida radioaktiv belgi bo'ladi.

1970-yillarning boshlarida cheklovchi fermentlar topilgach, Dana va Natans ulardan sutemizuvchilar polioma virusi, simian virusi 40 (SV40) ni diskret bo'laklarga bo'lish uchun ishlatishlari mumkinligini tushunishdi. Virusli DNK sintezining kelib chiqishi va oxirini aniqlash uchun ular quyidagi impuls belgilarini qo'llash usulidan foydalanganlar. Madaniyatda o'sadigan maymun hujayralari SV40 bilan kasallangan va keyin 5, 10 va 15 daqiqa davomida [3 H] timidin bilan puls bilan etiketlangan. Yakunlangan virusli DNK molekulalari ajratilgan, cheklovchi endonukleazlar bilan hazm qilingan. H. grippi (aralashmasi Hind II va Hind III), poliakrilamid jelda ajratilgan va DNKga kiritilgan [3 H] miqdori aniqlangan. Cheklov fragmentlarining turli o'lchamlari va asosiy tarkibini normallashtirish uchun [3 H] sonlari [32 P] fosfat bilan bir xil tarzda etiketlangan DNKning bir xil cheklash fragmentlaridagi [32 P] miqdoriga bo'lingan. Yuqorida aytib o'tilganidek, impuls belgisi uzunligi DNK molekulasining to'liq sintezi uchun zarur bo'lgan vaqtdan qisqaroq bo'lsa, yorliq birinchi navbatda terminalga yaqinroq bo'laklarda paydo bo'ladi. Puls bilan belgilangan (yangi sintez qilingan) DNK paydo bo'lganidek yakunlandi Quyidagi rasmlarda va ularning qog'ozidan moslashtirilgan jadvalda ko'rsatilganidek, DNK molekulalari, tugallangan molekulalar bo'ylab yorliq gradienti kuzatildi.

6.3-rasm SV40 ning cheklash xaritasi

6.1-jadval. Tugallangan SV40 DNK molekulalarining cheklash bo'laklarida radioyorliqning ko'rinishi. Har bir cheklov fragmentidagi impuls yorlig'ining nisbiy miqdori quyida keltirilgan (impuls yorlig'ining nisbiy miqdori har bir fragmentning 3 H/32 P nisbati bo'lib, timidin tarkibi uchun tuzatilgan va A fragmenti uchun 1 ga normallashtirilgan).


Ma'lumotnomalar

Tang, M. va boshqalar. SOS mutagenezining biokimyoviy asoslari Escherichia coli: qayta qurish in vitro UmuD 2′C mutagen kompleksi va RecA oqsiliga bog'liq bo'lgan lezyonni aylanib o'tish. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 95, 9755–9760 (1998).

Tang, M. va boshqalar. UmuD'2C - xatoga moyil DNK polimeraza, Escherichia coli pol V. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 95, 8919–8924 (1999).

Vagner, J. va boshqalar. The dinB gen romanni kodlaydi Escherichia coli DNK polimeraza (DNK pol IV). Mol. Hujayra 40, 281–286 (1999).

Fridberg, E. C., Uoker, G. C. va Siede, V. DNK reparatsiyasi va mutagenez 407-522 (ASM, Vashington, 1995).

Kato, T. & Shinoura, Y. ning mutantlarini ajratish va xarakterlash Escherichia coli ultrabinafsha nurlar ta'sirida mutagenez induksiyasida etishmovchilik. Mol. General Genet. 156, 121–131 (1977).

Bonner, C. A., Hays, S., MakEnti, K. va Gudman, M. F. DNK polimeraza II DNK shikastlanishi bilan kodlangan dinA geni Escherichia coli. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 87, 7663–7667 (1990).

Brotocorne-Lannoye, A. & Maenhaut-Mishel, G. Bakteriofag l ning maqsadsiz UV mutagenezida RecA oqsilining roli: dinB gen. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 83, 3904–3908 ( 1986).

Kim, S.-R. va boshqalar. SOS sabab bo'lgan mutagenezning bir nechta yo'llari Escherichia coli: ning haddan tashqari ifodasi dinB/dinP DNKga zarar yetkazish uchun hech qanday ekzogen davolash bo'lmaganda mutagenezning kuchli kuchayishiga olib keladi. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 94, 13792– 13797 (1997).

Knippers, R. DNK polimeraza II. Tabiat 228, 1050– 1053 (1970).

Rangarajan, S., Vudgeyt, R. Gudman, M.F. DNK-polimeraza II-ning sirli fenotipi: ultrabinafsha nurlanishida replikatsiyani qayta boshlashda pol II ning hal qiluvchi roli. Escherichia coli . Proc. Natl akad. Sci. AQSH 96, 9224 –9229 (1999).

Lindal, T. DNK ta'mirlash fermentlari. Annu. Rev. Biochem. 51, 61–87 (1982).

Banerji, S. K., Kristensen, R. B., Lourens, C. V. va LeKlerk, J. E. Yagona tomonidan ishlab chiqarilgan mutatsiyalarning chastotasi va spektri cis-sin bir ipli vektorda timin-timin siklobutan dimer. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 85, 8141– 8145 (1988).

Lourens, C. V., Borden, A., Banerji, S. K. va LeKlerk, J. E. Bir ipli vektorda bitta abasik joydan kelib chiqadigan mutatsiya chastotasi va spektri. Nuklein kislotalari Res. 18, 2153– 2157 (1990).

LeKlerk, J. E., Borden, A. & Lawrence, C. W. Timin-timin pirimidin-pirimidon (6-4) ultrabinafsha nurli fotomahsulot juda mutagen va ayniqsa timindan sitozinga 3' o'tishni qo'zg'atadi. Escherichia coli. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 88, 9685– 9689 (1991).

Rajagopalan, M. va boshqalar. DNK polimeraza III tomonidan abasik DNK lezyonlarini replikativ aylanib o'tishda tozalangan mutagenez oqsillari UmuC, UmuD' va RecA faolligi. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 89, 10777 –10781 (1992).

Creighton, S., Bloom, L. B. va Gudman, M. F. in Usullari Enzimol. jild. 262 (Tahr. Kempbell, J. L.) 232–256 (Akademik, San-Diego, 1995).

Smit, C. A. va boshqalar. Timidilil-(3'→5')-timidinning saytga xos cis-sin, trans-sin-I, (6-4) va devar pirimidon fotomahsulotlarini o'z ichiga olgan M13 vektorlarining mutatsiya spektrlari. Escherichia coli SOS sharoitida. Biokimyo 35, 4146–4154 (1996).

Lourens, C. V., Banerji, S. K., Borden, A. va LeKlerk, J. E. T-T Siklobutan dimerlari noto'g'ri, noto'g'ri, mutagen lezyonlar emas. Mol. General Genet. 166, 166–168 (1990).

Fijalkowska, I. J., Dann, R. L. & amp Schaaper, R. M. Genetik talablar va mutatsion o'ziga xoslik Escherichia coli SOS mutator faoliyati. J. Bakteriol. 179, 7435–7445 ( 1997).

Bloom, L. B. va boshqalar. ning sodiqligi Escherichia coli DNK polimeraza III holoenzimi: b, g kompleks qayta ishlash oqsillari va e tekshiruvchi ekzonukleazaning nukleotidlarning noto'g'ri korporatsiyasi samaradorligiga ta'siri. J. Biol. Kimyo. 272, 27919–27930 ( 1997).

Sommer, S., Boudsocq, F., Devoret, R. & Bailone, A. RecA aminokislotalarining o'ziga xos o'zgarishi RecA-UmuD'C o'zaro ta'siriga ta'sir qiladi. Mol. Mikrobiol. 28, 281–291 ( 1998).

Menetski, J. P. & Kovalchikovski, S. C. RecA oqsilining bir zanjirli DNK bilan o'zaro ta'siri: nukleotid kofaktorlari bilan bog'lanish afiniteti modulyatsiyasining miqdoriy jihatlari. J. Mol. Biol. 181, 281–295 (1985).

Reuven, N. B., Arad, G., Maor–Shoshani, A. & Livneh, Z. UmuC mutagen oqsili UmuD', RecA va SSB tomonidan faollashtirilgan DNK polimeraza bo'lib, transleziya replikatsiyasiga ixtisoslashgan. J. Biol. Kimyo. 274, 31763–31766 ( 1999).

Radman, M. Evolyutsion o'zgarish fermentlari. Tabiat 401, 866–869 (1999).

McDonald, J. P. va boshqalar. Inson va sichqonlarning yangi gomologlari Saccharomyces cerevisiae DNK polimeraza ē. Genomika 60, 20–30 (1999).

Gerlax, V. L. va boshqalar. Odam va sichqon gomologlari Escherichia coli DinB (DNK polimeraza IV), UmuC/DinB superoilasi a'zolari. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 96, 11922–11927 (1999).

Naktinis, V., Tyorner, J. & O'Donnell, M. Protein halqalari uchun ichki raqobat bilan aniqlangan replikatsiya mashinasidagi molekulyar kalit. Hujayra 84, 137–145 (1996).

Jing, Y., Kao, J. F.-L. & amp Teylor, J.-S. Mos keladigan va mos kelmaydigan DNK dodekamer duplekslarining termodinamik va tayanch-juftlik tadqiqotlari cis-sin, (6-4) va TTning Dewar fotomahsulotlari. Nuklein kislotalari Res. 26 , 3845–3853 (1998).

Bambara, R. A., Fey, P. J. & Mallaber, L. M. Protsessuallikni tahlil qilish usullari. Usullari Enzimol. 262, 270–280 ( 1995).

Bruk, I., Vudgeyt, R., MakEnti, K. va Gudman, M. F. dan eruvchan UmuD'C kompleksini tozalash Escherichia coli. UmuD'C ning bir zanjirli DNKga kooperativ bog'lanishi. J. Biol. Kimyo. 271, 10767–10774 ( 1996).


6.4.2 Mashina va fermentlar

Tirik hujayralarda, masalan, E. coli, replikatsiya jarayoni katalizatorlar (fermentlar) to'plamini talab qiladi. Asosiy ferment DNKga bog'liq DNK polimeraza deb ataladi, chunki u deoksinukleotidlarning polimerizatsiyasini katalizlash uchun DNK shablonidan foydalanadi.

Ushbu fermentlar juda samarali fermentlardir, chunki ular juda qisqa vaqt ichida ko'p miqdordagi nukleotidlarning polimerizatsiyasini katalizlashi kerak. Faqat 4,6 × 106 bp bo'lgan E. coli (uni diploid miqdori 6,6 × 109 bp bo'lgan odam bilan solishtiring) replikatsiya jarayonini 38 daqiqa ichida yakunlaydi, ya'ni polimerlanishning o'rtacha tezligi soniyada taxminan 2000 bp bo'lishi kerak.

Bu polimerazalar nafaqat tez, balki reaksiyani yuqori aniqlik bilan katalizlashi ham kerak. Replikatsiya paytidagi har qanday xato mutatsiyaga olib keladi. Bundan tashqari, energetik replikatsiya juda qimmat jarayondir. Deoksiribonukleozid trifosfatlar ikki tomonlama maqsadlarga xizmat qiladi.

Substrat vazifasini bajarishdan tashqari, ular polimerizatsiya reaktsiyasini energiya bilan ta'minlaydi (deoksinukleozid trifosfatlardagi ikkita terminal fosfat ATP holatidagi kabi yuqori energiyali fosfatlardir). Replikatsiya jarayonini yuqori aniqlik bilan yakunlash uchun DNKga bog'liq DNK polimerazalardan tashqari ko'plab qo'shimcha fermentlar talab qilinadi.

Uzoq DNK molekulalari uchun DNKning ikkita zanjirini butun uzunligi bo'yicha ajratib bo'lmaydiganligi sababli (juda yuqori energiya talabi tufayli), replikatsiya replikatsiya vilkalari deb ataladigan DNK spiralining kichik ochilishida sodir bo'ladi. DNKga bog'liq DNK polimerazalar polimerizatsiyani faqat bitta yo'nalishda, ya'ni 5'Æ3'da katalizlaydi. Bu replikatsiya vilkalarida ba'zi qo'shimcha asoratlarni keltirib chiqaradi.

Demak, bir ipda (qutbliligi 3'Æ5' bo'lgan shablon) replikatsiya uzluksiz, ikkinchisida (5'Æ3' qutbli shablon) uzluksiz. Uzluksiz sintez qilingan fragmentlar keyinchalik DNK ligaza fermenti bilan birlashadi (6.8-rasm). DNK polimerazalari o'z-o'zidan replikatsiya jarayonini boshlay olmaydi.

Shuningdek, replikatsiya DNKning biron bir joyida tasodifiy boshlanmaydi. E. coli DNKsida replikatsiya kelib chiqadigan aniq hudud mavjud. Bunday hududlar replikatsiyaning kelib chiqishi deb ataladi. Replikatsiyaning kelib chiqishi talabi tufayli, agar rekombinant DNK protseduralari paytida ko'payish kerak bo'lsa, DNKning bir qismi vektorni talab qiladi.

Vektorlar replikatsiyaning kelib chiqishini ta'minlaydi. Bundan tashqari, replikatsiyaning har bir tafsiloti yaxshi tushunilmaydi. Eukariotlarda DNK replikatsiyasi hujayra siklining S fazasida sodir bo'ladi. DNK replikatsiyasi va hujayra bo'linish sikli yuqori darajada muvofiqlashtirilgan bo'lishi kerak. DNK replikatsiyasidan so'ng hujayra bo'linishining buzilishi poliploidiyaga (xromosoma anomaliyasi) olib keladi. Yuqori sinflarda siz ushbu saytda kelib chiqish tabiati va sodir bo'ladigan jarayonlarni batafsil o'rganasiz.


Videoni tomosha qiling: DNA Replication in Prokaryotes. Initiation (Dekabr 2021).