Ma `lumot

Sarum oqsillarini FPLC asosida ajratish

Sarum oqsillarini FPLC asosida ajratish



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Men neyro-rivojlanish kasalliklarida bio-markerni kashf qilishni o'z ichiga oladigan loyiha ustida ishlayapman. Mening laboratoriyamda akta-prime FPLC asbobi bor, lekin men uni qanday ishlatishni bilmayman.

Nazariyaga ko'ra, plazma yoki sarum odatda yuqori molekulyar og'irlikdagi ko'plab oqsillarni o'z ichiga oladi - bu mening tadqiqotimga tegishli bo'lishi mumkin bo'lgan kichik molekulyar og'irlikdagi oqsillarning kontsentratsiyasini yashirishi mumkin.

Men bunday oqsil molekulalarining g'ayritabiiy ifodasini qidiryapman.
Agar men zardob namunasini to'g'ridan -to'g'ri ishga tushirsam, kerakli molekulani aniqlashga imkon beradigan juda ko'p tasmalar olishidan xavotirdaman.

Bunday niqoblangan oqsillarni zardobdan ajratish uchun qaysi ustundan foydalanish kerak - yoki, avvalgi qanday ajratish kerak?

Bundan tashqari, qanday reagent konsentratsiyasidan foydalanishim kerak (ayniqsa, qayta bog'lovchi bufer va elüsyon buferi)?


Birinchidan, taklif qila olaman 2D elektroforez oqsil/marker ifoda darajalaridagi farqlarni aniqlash usuli sifatida. Bu usul sizga katta aniqlik va namunangizni asosan bir qadamda/tajribada solishtirish qulayligini beradi. Siz qiziqqan oqsilni aniqlagandan so'ng, bonus qo'shiladi, siz uni osonlikcha ekskursiya qilishingiz va oqsilingizni aniqlash uchun ommaviy tahlilga yuborishingiz mumkin. Qisqacha aytganda, 2D elektroforez oqsilni 1 -o'lchovdagi pI (izoelektr nuqtasi) ga, so'ngra 2 -o'lchovdagi o'lchamiga qarab ajratadi. Siz qiziqqan oqsilni aniqlagandan so'ng, uni quyidagi amallar yordamida tozalashingiz mumkin.

Rasm manbai

Endi tahlil qilish uchun oqsillarni ajratish muammosini hal qilishga o'ting. Proteinni ajratish uchun siz amal qilishingiz mumkin bo'lgan umumiy sxema quyidagicha:

  1. Ion almashish ustuni
  2. Gidrofobik shovqin ustuni (HIC)
  3. O'lchov-istisno xromatografiyasi (SEC)

Ion almashinuvi birinchi navbatda, chunki siz ko'tarilgan tuz konsentratsiyasi (0 --> 1M NaCl) yordamida oqsilni ustundan ajratib olasiz. Proteinni HIC ustuniga yuklash uchun sizga tuzning yuqori konsentratsiyasi kerak bo'ladi. Shunday qilib, 1 -sozlamadagi elutani 5M (Nh4) 2SO4 bilan osonlik bilan bog'lab, HIC ustuniga yuklash mumkin (dializsiz). Bundan tashqari, ion almashinuvi va HIC-yuqori sig'imli ustunlar bo'lib, ularning o'lchamlarini tuzli gradientlar yordamida yaxshilash mumkin, shuning uchun mening tavsiyam birinchi bo'lib ishlatiladi. Ammo, agar siz qiziqqan markeringiz/oqsilingiz kichikligiga amin bo'lsangiz, to'g'ridan -to'g'ri SEC ustunidan foydalanishingiz mumkin

Ion almashinuvi ustuni, nomidan ko'rinib turibdiki, oqsilni zaryadiga qarab ajratadi (Kamida ---> Eng ionli, shuningdek, pH zaryadidagi +/- oqsil zaryadini ham qayd eting). Ion almashinuvi uchun ishlatiladigan bufer:

1. Bog'lovchi bufer 10-50 mM fosfat buferi pH7,4 (plazma pH) 0-25 mM NaCl 2. Elutsiya buferi 10-50 mM fosfat tamponi pH7,4 1M NaCl

Ustunga eng samarali bog'lanish uchun iloji boricha past tuzdan foydalaning. Elyusiya NACL gradienti bilan 0% elyusiya tamponidan 100% gacha boʻlgan gradient bilan amalga oshiriladi, taxminan ~20 ustun hajmida.

HIC ustuni oqsilni hidrofobligi bo'yicha ajratadi. Ustunni elutsiya qilish tartibi eng kam --> eng hidrofobik.

1. Bog'lovchi tampon 10-50mM fosfat buferi 1M (Nh4) 2SO4 2. Elüsyon buferi 10-50mM fosfat buferi (Tuzsiz)

Bu yerda HIC uchun yaxshi protokolni topishingiz mumkin. Elüsyon, shuningdek, 0-100% elüsyon tampon gradyanlı ~ 20 CV dan ortiq, ion almashinuvi elüsyonuna o'xshab amalga oshiriladi.

Nihoyat, o'lchovni istisno qilish yoki SEC oqsillarni kattaligiga qarab ajratadi. Tozalash tartibi-eng kichik o'lcham. Ustun izokratik rejimda ishlaydi, ya'ni faqat bitta bufer ishlatiladi. Tampon tarkibi:

1. 50-100 mM fosfat buferi 2. 150mM NaCL

Buferdagi tuz oqsilning kolonna bilan o'ziga xos bo'lmagan o'zaro ta'sirini oldini oladi, bu esa oqsilning zarur bo'lgandan kechroq chiqishiga olib kelishi mumkin. Bu yomon qarorga olib kelishi mumkin.

Tushunish kerak bo'lgan eng muhim narsa shundaki, yuqoridagi ustunlarning har biri o'z g'orlari to'plamiga ega. 1) Ion almashinadigan ustunlar oqsil zaryadiga xosdir, shuning uchun siz kolonna turiga (anion/kation) qarab umuman bog'lanmaydigan ko'p proteinga ega bo'lasiz. 2) Xuddi shunday, HIC ustuni ham sizning oqsilingizga yaxshi bog'lanmasligi mumkin. Bundan tashqari, 1M (Nh4) 2SO4 qo'shilishi sizni qiziqtiradigan oqsilni o'z ichiga olishi mumkin bo'lgan oqsillarni hosil qiladi. 3) SEC ustunlari qabul qila oladigan oqsil hajmining yuqori chegarasiga ega, undan yuqori barcha oqsillar bo'shliq hajmida birlashadi va piksellar sonini kamaytiradi (Ammo, bu sizning holatingizda muammo bo'lmasligi kerak, chunki siz past molekulyar og'irlikni ajratishga harakat qilyapsiz). yuqori vaznli proteinlar.)

Nihoyat, yuqorida aytilganlarning hammasi, agar siz oqlamoqchi bo'lgan oqsilni bilsangiz (alohida), juda yaxshi ishlaydi. Agar bunday bo'lmasa, siz har bir ustunni tozalash bosqichida SDS-gel fraktsiyalarining elektroforezini yig'ishingiz va ishga tushirishingiz kerak bo'ladi. Shuningdek, qaysi oqsil boshqacha ifodalanganligini aniqlash uchun nazorat va namuna plazmasini yonma-yon taqqoslang.

Xulosa qilib shuni ta'kidlashni istardimki, 2D elektroforez sizga rasmda ko'rsatilganidek, solishtirish uchun jel beradi. Shunday qilib, bu sizning muammoingizni hal qilishning eng yaxshi usuli bo'lishi mumkin. Ammo, tan olaman, topilmalaringizni tasdiqlash uchun tozalashni o'rnatishingiz kerak bo'ladi.

Umid qilamanki, bu omad!


Inson zardobida alyuminiyning kimyoviy turlanishi

Inson sarumining past molekulyar massasi (LMM) va yuqori molekulyar massasi (HMM) fraktsiyalarida alyuminiyning kimyoviy spetsifikatsiyasi muhokama qilinadi. Bu erda inson zardobidagi alyuminiyning spetsifikatsiyasi uchun tavsiflangan turli xil tahliliy protseduralar bo'yicha adabiyotlarning tanqidiy sharhi keltirilgan. Inson zardobida HMM va LMM alyuminiy turlarini aniqlash uchun metodologiyalar, eksperimental va instrumental talablar va hisobot qilingan analitik protseduralarning qobiliyati batafsil ko'rib chiqiladi. Alyuminiyni aniqlash uchun elektrotermik atomik yutilish spektrometriyasi bilan bog'langan xromatografik bo'lmagan ajralishlar xromatografik usullar (o'lchamni istisno qilish xromatografiyasi, anion almashinuvi xromatografiyasi va tez oqsil suyuqlik xromatografiyasi) bilan ETAAS yoki induktiv ravishda bog'langan plazma massa spektrometriyasi (ICP-MS) aniqlash uchun taqqoslanadi. HMM turlarini o'rganish. Al-LMM birikmalari uchun xabar qilingan tadqiqotlar va texnikalar ham sog'lom ko'ngillilar, ham dializ bemorlari uchun umumlashtirilgan. Haqiqiy sarum tahlilida ishlab chiqilgan analitik protseduralarni qo'llash natijasida olingan ma'lumotlarga asoslanib, inson zardobidagi Alning ko'p qismi Al-transferrin bilan, LMM-Al fraktsiyasi bilan (10–20%) bog'langanligi isbotlangan. umumiy Al) asosan Al-sitrat, Al-fosfat va uchlik Al-sitrat-fosfat komplekslarini o'z ichiga oladi.


Ta'riflar

Elektroforez - oqsillarni fizik xususiyatlariga qarab ajratish usuli. Sarum ma'lum bir muhitga joylashtiriladi va zaryad qo'llaniladi. Proteinning aniq zaryadi (ijobiy yoki manfiy) va hajmi va shakli odatda turli zardob oqsillarini farqlashda ishlatiladi.

Sarum oqsil elektroforezining bir nechta kichik to'plamlari mavjud. Ushbu kichik guruhlarning nomlari sarumning turli tarkibiy qismlarini ajratish va farqlash usuliga asoslangan. Zonali elektroforezda, masalan, turli xil oqsil subtiplari agar, tsellyuloza yoki boshqa o'simlik materiallaridan tayyorlangan jelda alohida jismoniy joylarga joylashtiriladi.2 , 3 Proteinlar bo'yaladi va ularning zichligi elektron shaklda hisoblab chiqiladi va grafik ma'lumotlarni taqdim etadi. turli oqsillarning mutlaq va nisbiy miqdori. Protein subtipalarini keyingi ajratishga immunologik faol vosita bilan bo'yash orqali erishiladi, natijada immunofloresans va immunofiksatsiyaga olib keladi.


Elektroforez: ajratish va tahlil qilish

Oldingi laboratoriyada biz zarrachaning suyuq muhitdagi harakatini muhokama qildik, bu erda cho'kma kuchi tortishish kuchi (oqayotgan suyuqlikda), va qarama -qarshi zarracha tezligiga mutanosib ishqalanish kuchi edi. Bu kuchlar teskari yo'nalishda harakat qiladi va oxir -oqibat bir -birini muvozanatlaydi, bu esa zarrachaning harakatlanuvchi suyuqlik muhitida bir xil harakatlanishiga olib keladi (ya'ni, zarracha doimiy tezlikda harakat qiladi). Agar tashqi maydon tortishish maydoni o'rniga elektr maydoni bo'lsa, makromolekulaning tashqi maydonga javob berishining ikki yo'li mavjud. Agar molekula zaryadlangan bo'lsa, u elektr maydonida qarama -qarshi zaryadli elektrodga o'tadi. Bu elektroforez texnikasining asosi. Agar makromolekula zaryadning assimetrik taqsimlanishiga ega bo'lsa (ya'ni doimiy dipol momenti bo'lsa), molekula elektr maydoniga yo'nalishga moyil bo'ladi. Bu tamoyil elektr ikki sinishi va dikroizm texnikasi uchun asos bo'lib xizmat qiladi. Biz faqat elektroforez haqida gaplashamiz.

Zaryadlangan zarrachaning (+Q) elektr maydonida (E) o‘tkazmaydigan muhitda, masalan, suvda harakatlanishining oddiy holatini ko‘rib chiqaylik. Agar zarracha katod tomon doimiy tezlikda harakat qilsa (- elektrod), aniq kuch Fjami zarrachada 0 ga teng (chunki F = ma, va zarrachaning tezlanishi (a) doimiy tezlikda 0 ga teng). Zarrachaga ikkita kuch ta'sir qiladi, biri FE., zaryadlangan zarrachaga harakat yo'nalishi bo'yicha (katod tomon) bo'lgan maydon tomonidan qo'llaniladigan kuch, ikkinchisi - Ff, zaryadlangan zarrachadagi ishqalanish kuchi, u katod tomon o'z harakatini kechiktiradi va shuning uchun harakatga qarama -qarshi yo'nalishda (anod (+) elektrod tomon). Bu quyidagi diagrammada ko'rsatilgan:

(1) F.jami = Fe + Ff = 0, bu erda
(2) Fe = QE (elektr kuchi) va
(3) F.f = -fv (ishqalanish kuchi),

Bu erda v - zarrachaning tezligi, f - ishqalanish koeffitsienti deb ataladigan doimiy. (3) tenglama shuni ko'rsatadiki, F kuchif katod tomon harakatlanishiga to'sqinlik qiladigan zarracha tezligiga mutanosib. Bu intuitivdir, chunki tezlik qanchalik baland bo'lsa, F katta bo'ladif bu harakatga xalaqit beradi. Ishqalanish koeffitsienti molekula hajmi va shakliga bog'liq. Molekula qanchalik katta bo'lsa, ishqalanish koeffitsienti shunchalik katta bo'ladi (ya'ni molekulaning harakatiga qarshilik). Sferik zarracha uchun ishqalanish koeffitsienti tomonidan berilganligini ko'rsatish mumkin

bu erda & eta - yopishqoqlik (suyuqlik oqimiga qarshilik o'lchovi - suv past yopishqoqlikka ega, haqiqiy chinor siropi yuqori yopishqoqlikka ega) va Rs (Stokes radiusi) - gidratlangan sfera radiusi (kattaroq R.s, ishqalanish koeffitsienti qanchalik katta bo'lsa, F katta bo'ladif katod tomon harakatlanishiga qarshilik ko'rsatadi). (1), (2) va (3) dan F.e = Ff , yoki

Demak, v/E = Q/f = U = elektroforetik harakatchanlik, yoki

Shuning uchun, elektroforetik harakatchanlik U zaryad zichligiga mutanosib (zaryad/kattalik, Q/R)s) zarrachadan. Zaryad zichligi har xil bo'lgan makromolekulalarni elektroforez yordamida ajratish mumkin. Bu munozara eng oddiy holat bilan bog'liq, chunki aslida eritmada (tuzlardan) zaryadlangan makromolekula atrofida bulut hosil qiladigan va zaryadlangan zarrachani elektr maydonidan qisman himoya qiladigan qarshi ionlar mavjud.

Zamonaviy elektroforez polimerizatsiya agenti qo'shilgandan keyin suyuq akrilamid eritmalaridan hosil bo'lgan qattiq jellarda (masalan, poliakrilamid) o'tkaziladi. Qattiq jel erigan va erituvchi molekulalar uchun g'ovak bo'lib, elektroforez uchun vosita bo'lib xizmat qiladi va suyuqlikdagi konvektsiya kuchlarini yo'q qilishga yordam beradi, bu esa ajratishga xalaqit beradi. Bunday buzilishlarning oldini olish maqsadida, vaznsiz sharoitda kosmik kemada elektroforetik tajriba o'tkazildi.

Poliakrilamid jellaridagi elektroforezning idealizatsiyalangan ta'rifiga ta'sir qiladigan murakkabliklardan biri shundaki, jellarda makromolekulalar harakatlanadigan teshiklari bor. Jel xromatografiyasida bo'lgani kabi, kichikroq molekulalar teshiklardan katta molekulalarga qaraganda osonroq o'tishi mumkin, shuning uchun qo'shimcha elaklash mexanizmi mavjud. samarali harakatchanlik (Shuningdek, jel mahalliy samarali elektr maydonini o'zgartirishi mumkin). Jelning elakdan o'tkazish effekti aslida ushbu texnikaning hal qilish kuchini oshiradi.

Proteinning haqiqiy elektroforetik harakatchanligi U ning konsentrlangan saxaroza eritmasi (Uo) va T tarkibidagi oqsil harakatchanligi, polimerlangan jeldagi akrilamidning umumiy kontsentratsiyasi ekanligi aniqlandi. Polimerlashtirilmagan gel eritmasida akrilamid konsentratsiyasi qanchalik yuqori bo'lsa, polimerlangan geldagi teshiklarning hajmi shunchalik kichik bo'ladi. U, Uo va T o'rtasidagi munosabatni ko'rsatuvchi tenglama quyida ko'rsatilgan:

qaerda Kr ma'lum bir oqsil uchun log U va T uchastkasining qiyaligi. Chunki Kr molekula radiusining funktsiyasidir, har xil akrilamid konsentratsiyali (T) jellarda bir nechta elektroforetik ajratish va natijalarni T = 0 ga ekstrapolyatsiya qilish orqali oqsil molekulasining molekulyar og'irligini aniqlash mumkin, shuning uchun teshik hajmi ta'sirini yo'q qilish mumkin. . Ammo, agar oqsillar sferik shaklga ega bo'lmasa, muammolar paydo bo'ladi

Bitta jel ustida poklikni aniqlashdan tashqari, molekulyar og'irlik ma'lumotlarini olishning biron bir usuli bormi? Agar bitta akrilamid jeli ustida har biri bir xil molekulyar og'irlikdagi va umumiy zaryadli, lekin har xil shaklga ega bo'lgan ikki xil oqsil ishlatilsa nima bo'ladi? Ko'proq cho'zilgan shaklga ega bo'lgan (katta Stokes radiusi) elektroforetik harakatchanlikka ega bo'ladi (U = Q/6 & pi&etaR)s). Kattaroq Rs, shuningdek, oqsilning teshiklarga sekinroq kirishiga olib keladi. Shunday qilib, elektroforetik harakatchanlik va elak effektlari bu oqsilni anomal ravishda sekin ishlashiga va yuqori molekulyar og'irligiga ega bo'lishiga olib keladi. Shuningdek, turli o'lchamdagi, ammo kompensatsion zaryad farqlari bo'lgan ikkita globulyar oqsilni tasavvur qiling, bu ikkala oqsilning jelda bir xil tezlikda ko'chishiga imkon beradi.

Bitta jelda elektroforetik yugurishni izohlashni soddalashtirish uchun ishlatiladigan keng tarqalgan usul bu denaturing sharoitida jelni ishlatishdir. Tanlangan denaturant odatda natriy dodesil sulfatdir (SDS), u CH tuzilishiga ega ionli yuvish vositasidir.3(CH2)10CH2OSO3 - (bir zanjirli amfifil). Bu detarjen ko'pchilik oqsillarni bog'laydi va denaturatsiyalaydi, taxminan 1,4 g SDS bog'lovchi/g protein (taxminan 1 SDS/2 aminokislotalar). 1 ta manfiy zaryad/SDS bo'lgani uchun, SDS ulanishi oqsil zaryadlarining har qandayini yashiradi va barcha oqsillarga umumiy katta manfiy zaryad beradi. Qo'shimcha, SDS-oqsillar majmuasi, odatda, silindrsimon uzunchoq shakliga ega ekanligi ko'rsatilgan. Birlik massa oqsiliga bog'langan SDS miqdori doimiy bo'lgani uchun, barcha oqsillarning umumiy zaryad zichligi o'xshash, shuning uchun elektroforetik harakatchanlik faqat elak effektlari bilan aniqlanadi. SDS shuningdek, elakni belgilaydigan o'zgaruvchi sifatida oqsillar shaklidagi farqlarni yo'q qiladi, chunki barcha oqsillar bir xil umumiy tayoqchaga o'xshash shaklga ega. (SDS dan foydalanish molekulyar og'irliklarni aniqlash uchun oqsillarni jel kromatografik ajratishda 8M karbamiddan foydalanishga o'xshaydi). Harakatlanish shakli emas, balki oqsilning molekulyar og'irligiga bog'liq. Noma'lum oqsilning molekulyar og'irligini oqsilning SDS poliakrilamid jelidagi o'rnini bir qator ma'lum molekulyar og'irlik standartlari bilan solishtirish orqali aniqlash mumkin, ulardan ln Mr vs R ning chiziqli sxemasi.f noma'lum molekulyar og'irliklarni hisoblash uchun ishlatilishi mumkin. Bu gel xromatografiyasidagi tahlilga o'xshaydi, bu erda ln Mr K ning chiziqli funktsiyasidiro'rtacha, taqsimlash koeffitsienti, jel denatürasyon sharoitida ishlaganda. Biroq, ba'zi oqsillar anormal tarzda bunday jellarda ishlaydi (to'liq bo'lmagan yoki ortiqcha bog'lovchi SDS tufayli), shuning uchun molekulyar og'irlikni aniqlashning muqobil usullarini ushbu texnika bilan birgalikda ishlatish kerak.

Proteinlar odatda SDSda 3 minut davomida 100 o C gacha qizdiriladi, b-merkaptoetanol kabi qaytaruvchi vosita ishtirokida, oqsilni tayoq shaklidagi oqsilga to'liq denatatsiya qilish uchun. Ko'rinib turgan molekulyar og'irlikni kamaytirilmaydigan sharoitda olish mumkin (b-ME holda), lekin ularni faqat taxminlar deb hisoblash kerak. Oqsillarni kamaytiruvchi vosita borligida ham, yo'qligida ham ishlatish oqsilning bo'linmas tuzilishi haqida muhim ma'lumot berishi mumkin. Subbirliklari disulfid bog‘lari bilan tutashgan multimerik oqsil, qaytaruvchi qo‘shilganda uning alohida komponentlariga ajralishi mumkin. Agar subbirliklar kovalent bo'lmagan molekulalararo tortishishlar tomonidan bir-biriga bog'langan bo'lsa, oqsillar denaturatsiya sharoitida (SDS) bir xil ishlaydi, bu esa b-ME bor yoki yo'qligida subbirliklarning o'zaro ta'sirini yo'q qiladi. Kovalent bo'lmagan o'zaro ta'sirlar bilan birlashtirilgan oqsilning bo'linmasining tarkibini aniqlash uchun denatürantlar bo'lmagan holda elektroforezni bajarish kerak.

  • Nobel elektron muzeyi: Virtual biokimyo laboratoriyasi. Ajratish zali: elektroforez - havolalarni kuzatib boring

Eslatma: Elektrod nomenklaturasi ba'zilaringizni chalkashtirib yuborishi mumkin. Yuqorida aytib o'tilganidek, kationlar katodga qarab harakatlanadi (qaytarilish sodir bo'ladi), shuning uchun katod salbiy bo'lishi kerak. Xuddi shunday, anion anod tomon siljiydi (bu erda oksidlanish sodir bo'ladi), shuning uchun anod musbat bo'lishi kerak. Bu, birinchi navbatda, galvanik hujayralarni muhokama qilganingizda, umumiy yoki analitik kimyodan eslashingiz mumkin bo'lgan narsaga ziddir. Galvanik hujayralarda elektr toki o'z-o'zidan sodir bo'ladigan redoks yarim reaksiyalar to'plamidan hosil bo'ladi. Biz elektrolitik hujayralar bilan ishlaymiz, masalan, suvning elektrolizida (2H2O(l) --> 2H2 (g) + O2(g)) yoki Cl ishlab chiqarishlarida2(g) va MgCl suvli elektrolitidan Mg (lar)2(aq). Elektrolitik hujayralarda yuqorida aytib o'tilganidek, o'z-o'zidan bo'lmagan (termodinamik jihatdan qulay bo'lmagan) reaktsiyalarni amalga oshirish uchun quvvat manbai oqim bilan ta'minlashi kerak. Quyidagi ko'rib chiqish rasmini ko'rib chiqing.

Galvanik va elektrolitik hujayralar

Konveksiya oqimlari bilan bog'liq har qanday muammolarni bartaraf etish uchun elektroforez gözenekli, ammo qattiq muhitda amalga oshiriladi. Bunday muhitlar agarozning suyuq eritmasi (asosan DNK bo'laklari va juda katta oqsillarni elektroforezi uchun ishlatiladi) yoki akrilamidning polimerizatsiyasi natijasida hosil bo'ladi. Akrilamidning polimerizatsiyasi tetrametilendiamin (TEMED) ishtirokida ammoniy persulfat qo'shilishi bilan boshlanib, akrilamid (N, N'-metilen-bis (akrilamid) dimeri bilan birga, metilen bilan akrilamidlarning amid nitrogenlari o'rtasida kovalent bog'langan. Bu birikmalarning tuzilishi quyida ko'rsatilgan:

Akrilamidning erkin radikal polimerizatsiyasi ammoniy persulfat qo'shilishi bilan boshlanadi, u suvda eriganda erkin radikallar hosil qiladi, quyida ko'rsatilgan:

Quyida ko'rsatilganidek, radikal akrilamidning polimerlanishini boshlaydi. TEMED erkin radikal sifatida mavjud bo'lish qobiliyati tufayli polimerizatsiya uchun qo'shimcha katalizator vazifasini bajaradi. Qattiq jel faqat hosil bo'ladi, lekin N, N'-metilen-bis (akrilamid polimerizatsiya paytida qo'shiladi, bu qo'shni akrilamid polimerlari bilan quyida ko'rsatilgandek bog'lanadi:

Polimerizatsiya paytida qo'shilgan bis miqdori o'zaro bog'lanish darajasini va shuning uchun polimerlangan jelning gözenek hajmini nazorat qiladi. Teshik kattaligining ta'siri QARShI Bunga jel xromatografiyasida. Ikkala holatda ham katta oqsillar teshikka kirishi qiyin. Jel xromatografiyasida katta oqsillar asosan harakatchan suyuqlik fazasiga (bo'shliq hajmi) bo'linadi va eng ko'p elutsiya qilinadi. TEZ ustundan. Elektroforezda jeldagi teshiklarga osonlikcha kira olmaydigan katta oqsillar elektr maydoni orqali jel orqali oson tashilmaydi va ko'p qismini elut qiladi. Sekin. Teshiklar hajmini jel xromatografiyasi qatronlar ishlab chiqarishda bo'lgani kabi aniq nazorat qilib bo'lmaydi.

Proteinlar jel orqali qanday o'tadi? Yopishqoq oqsil eritmasi polimerizatsiya jarayonida jelga quyilgan kichik quduqda jelning yuqori qismiga qatlamlanadi. Jelning pastki va yuqori qismlari tamponlangan eritma va tegishli elektrodni o'z ichiga olgan rezervuarlarga kiritiladi. Elektr maydoni qo'llaniladi va oqsillar gidratlangan jel orqali ko'chib ketadi. Rezervuardagi va polimerlangan geldagi bufer eritmaning tabiati muhim ahamiyatga ega. Tampon tarkibiy qismlari ajratiladigan oqsillarga bog'lanmasligi kerak. Bundan tashqari, muhitning pH darajasi shunday bo'lishi kerakki, oqsillar tegishli zaryadga ega bo'lishi kerak, shuning uchun ular kutilgan yo'nalishda ko'chib o'tadi.

Uzluksiz gel elektroforezi:

Odatda ishlatiladigan elektroforezning ko'plab variantlari mavjud. Jellarni naychalarda, plastinkalarda va denaturing agentlari bor yoki yo'qligida polimerlash mumkin. Bundan tashqari, ma'lum bir plastinka bir -birining ustiga polimerlangan ikkita alohida plitadan iborat bo'lishi mumkin, ularning har biri akrilamid konsentratsiyasi va pH darajasi har xil. Bu tur uzluksiz pH gel-elektroforez yoki disk-elektroforez deb ataladi. Biz bu texnikani bugungi laboratoriyada qo'llaymiz. Ikki xil pH va akrilamid konsentratsiyasi jeli (stacking gel va yugurish jeli) quyidagi rasmda ko'rsatilgan.

Stacking gel-past konsentratsiyali akrilamid (2-4%), Tris HCl tampon eritmasida (pH 6.5) polimerizatsiya qilingan, quyida ishlaydigan pH va quyi suv omborida ishlatiladi (Tris HCl tampon, pH 8.7). Pastki yoki ishlaydigan jel konsentratsiyasi ajratilishi kerak bo'lgan oqsillarning molekulyar og'irligiga qarab 7-15% akrilamid orasida o'zgarib turadi. Yuqori bufer suv omborida glisin (pKa2 = 9.6) kabi zaif kislota bilan ishlaydigan jel bilan bir xil pH darajasida tamponlangan Tris bor.

Uzluksiz pH -gel tizimini hal qilishning afzalliklari nimada? Asosiy afzallik shundaki, oqsillar tezda jelga kiradi va jelga kirmasdan oldin & quot; stack & quot; Bu oqsillarning ishlaydigan jelga kirmasidan oldin ularning ixchamligini oshiradi va piksellar sonini oshiradi. Bu yig'ish jarayoni qanday ishlaydi? Elektroforez boshlanganda, yuqori suv omboridan glitsin ionlari (pH 8,7 da) biriktiruvchi jelga kiradi, chunki bu pHda ular o'rtacha qisman manfiy zaryadga ega. Qatlamli jel tampon ionlari ketma -ketlikda harakat qilishni davom ettiradi, lekin glitsin ionlari ketma -ket jelning pH 6,5 ga kirganda, ular aniq zaryadli nolga teng bo'lgan zvitterionlarga aylanadi va shuning uchun anod tomon harakatni to'xtatadi. Iste'mol jeli ichidagi elektr qarshiligi ortadi, chunki ketma -ket jel orqali harakatlanadigan ionlar soni kamayadi. O'chirish davomida doimiy oqimni saqlab turish uchun mahalliylashtirilgan kuchlanishning oshishi stacking gel ichida (Ohms qonunidan, V = iR). Bu oqsillarni tez ko'chib ketishiga olib keladi va ularning hammasi yig'ish jelidagi Cl-ionlarining orqasida bitta ingichka diskda to'planadi (chunki ular zaryad zichligi va har qanday ionning elektroforetik harakatchanligiga ega). ). Proteinlar Cl-ionlarni o'tkaza olmaydi, chunki agar ular o'tgan bo'lsa, ular darhol sekinlashadi, chunki ular endi zaryadlangan tashuvchilar kamaygan va yuqori kuchlanish zonasida bo'lmaydilar. Qatlamli jel/ishlaydigan jel interfeysida, ko'proq konsentratsiyali jelning elak ta'siri tufayli, oqsillarning hammasi bir xil tezlikda ko'chib keta olmaydi va shuning uchun ular ishlaydigan jelda bo'linadi. Oxir-oqibat, glitsin ishlaydigan jelga kiradi, pH (8,7) da to'liq zaryadlangan holatini oladi, oqsillarni o'tkazadi va stacking gelida yuzaga kelgan zaryad etishmovchiligini tiklaydi.

Java ilovasi: Protein elektroforezi

Jel tarkibidagi oqsillarni aniqlash:

Aksariyat oqsillar yorug'likning ko'rinadigan to'lqin uzunliklarini o'zlashtirmaydi va shuning uchun elektroforez jarayonida ko'rinmaydi. Oqsillar jeldan quyi bufer rezervuarga elutsiya qilinmasligini ta'minlash uchun jelga joylashtirishdan oldin oqsilga kichik molekulyar og'irlikdagi anion bo'yoq, bromofenol ko'k qo'shiladi. Bo'yoq ishlaydigan jelning oxiriga yaqinlashganda elektroforez to'xtatiladi. Jel yig'ilishi elektroforez kamerasidan chiqariladi, shisha plitalar ajratiladi va jel ko'zga ko'rinadigan bantli oqsillarni ko'rsatish maqsadida bir qator eritmalarga yuviladi.

Hozirgi vaqtda bir nechta texnikalar qo'llanilmoqda. Eng keng tarqalgan - bu metanol/sirka kislotasi eritmasida erigan Coomassie Blue bilan jelni bo'yash. Ikkinchi laboratoriyada aniqlanganidek, oqsillar Coomassie Blue -ni bog'laydi, shu bilan birga bog'langan bo'yoqning yutilish xususiyatlarining spektral o'zgarishi. Bo'yoq eritmasidagi metanol va sirka kislotasi, shuningdek, jel tarkibidagi oqsilni "tuzatish" ga yordam beradi va uning eritma ichiga tarqalishini oldini oladi. Jel bo'yalganidan so'ng, jeldagi fon izlari sirka kislotasi/metanol bilan olib tashlanadi va ko'k rangli oqsillar qoladi. Yana bir eslatma: ba'zi oqsillar Coomassie ko'k bilan bo'yalmaydi. Bo'yashning yana bir keng tarqalgan usuli bu kumush rangni o'z ichiga oladi, bu Ag (I) ni oddiy kumushga aylantirishni va fotosurat jarayonidagi kabi, tegishli reaktsiya eritmalarida oqsil bilan birikishini o'z ichiga oladi. (BCA tahlilida esda tutingki, peptid birikmalari Cu (II) ni Cu (I) ga kamaytiradi, bu BCA ga xelatlangan.) Ishlab chiqaruvchi va tuzatuvchi yechim kerak. Ushbu usul Coomassie Blue bo'yashdan 10-50 X ko'proq sezgir. Proteinlarning elektroforezdan oldingi lyuminestsent yoki radioaktiv modifikatsiyasi yanada yuqori sezuvchanlikka imkon beradi. Radio etiketli oqsilni elektroforezidan so'ng, jelni quritib, past konsentratsiyali oqsil bilan plyonkaning etarli darajada ta'sirlanishini ta'minlash uchun, agar kerak bo'lsa, bir necha oy davomida rentgen plyonka bilan qoplash mumkin. Ushbu vizualizatsiya usullari avtoradiografiya deb ataladi.

Rasm: MW standartlariga ega SDS PAGE jeli

DNK bo'laklari odatda gorizontal agarozli jel tizimlarida ajratiladi, ularni quyish ancha oson.

Rasm: agaroz jelida ajratilgan DNK fragmentlari

Jel elektroforezidagi o'zgarishlar:

Izoelektrik fokus: Ushbu texnikada poliakrilamid jeli ichida pH gradienti o'rnatiladi. Bu amfolitlar deb ataladigan amino va karboksil guruhlarini o'z ichiga olgan past molekulyar og'irlikdagi molekulalarni oldindan elektroforez orqali amalga oshiriladi. Elektr maydoniga ta'sir qilganda, turlarning eng salbiylari anodda, eng ijobiylari esa katodga to'planadi. Qolgan amfolitlar o'rtada ko'chib o'tadi, aniq ta'sir amfolitlarning izoelektrik nuqtasiga ko'chib o'tishi va jelda chiziqli pH gradientini o'rnatishidir. Jelga qo'llaniladigan oqsil uning izoelektrik nuqtasiga mos keladigan pH ga o'tadi va to'xtaydi.

2D elektroforez: Bu odatda oqsillarni tor silindrsimon naychaga quyilgan poliakrilamid jelda izoelektrik fokusli elektroforezga o'tkazishni o'z ichiga oladi. Ushbu elektroforezdan so'ng, kolba jeli chiqariladi va ketma-ket jelning yuqori qismiga joylashtiriladi va dastlabki izoelektrik fokuslash tajribasidan 90o yo'nalishda SDS-poliakrilamid gel elektroforeziga o'tkaziladi. Agar oqsillar 35 Met bilan belgilangan hujayralardan olingan bo'lsa, ma'lum oqsillarni ifodalovchi ma'lum hujayralar populyatsiyasidan olinishi mumkin.

  • 2D elektroforetigramma misoli
  • Proteomika uchun 2D elektroforez

G'arbiy o'chirish: Standart SDS-plastinka elektroforez tajribasi o'tkazilgandan so'ng, jel nitroselülozli filtr qog'ozi bilan qoplangan. Jel va filtr qog'ozining sendvichi yana elektroforez kamerasiga joylashtiriladi, shunda oqsillar jeldan nitroselülozga ko'chib o'tadi va u erda qaytarilmas tarzda bog'lanadi. Filtr qog'ozini olib tashlash va nitroselülozada o'ziga xos antitelani o'z ichiga olgan eritmada namlash mumkin. Filtr qog'ozidagi bu oqsil-antikor kompleksini, masalan, birinchi antikorni bog'laydigan floresan yorliqli antikorni qo'shish orqali aniqlash mumkin.

Rasm: CKK47 ni aniqlash uchun SDS PAGE jeli va Western Blot

Rasm: Western Blotsda aniqlash

Floresans

Molekuladagi elektronlar energiyani o'zlashtirganda, ular yuqori elektron energiya holatiga ko'tariladi. Bu qo'zg'aluvchan elektronlar nurlanmaydigan yoki nurlanuvchi jarayonlarda asosiy holatga qaytishi mumkin. Radiatsion xiralashishda yorug'lik chiqariladi. Bu yorug'lik chiqarish jarayoni deyiladi lyuminesans, ularni ikki toifaga bo'lish mumkin:

  • floresans: Agar asosiy elektronlar juftligidan bitta elektron yuqori energiya holatiga qo'zg'alsa, qo'zg'algan elektronlar hali ham asosiy holati bilan bog'lanishi mumkin, ya'ni ular qarama -qarshi aylanishlarga ega. Qo'zg'algan elektron o'z aylanishini qaytarmasdan, asosiy holatga qaytishi mumkin. (Hayajonlangan holat a yakkalik S bilan holat, S = 2s +1 formulasi berilgan umumiy aylanish holati, bu erda s = o va S = 1 sinlget uchun.) Fotonning tez emissiyasiga olib keladigan bu jarayon & quot; spin ruxsat etiladi & quot; Foton emissiyasining tezligi taxminan 10 8 s -1 ni tashkil qiladi, bu esa hayot davomida (qo'zg'alish va emissiya o'rtasidagi o'rtacha vaqt) taxminan 10 ns ni tashkil qiladi.
  • fosforlilik: Agar yuqoridagi holatdan farqli o'laroq, qo'zg'algan elektronning aylanishi teskari o'girilsa, uning asosiy holatga qaytishi & quot; taqiqlangan & quot; chunki qo'zg'algan elektron va uning asosiy holati bir xil aylanish holatiga ega. (Hayajonlangan holat - a uchlik S bilan holat, umumiy aylanish holati, S = 2s +1 formulasi berilgan, bu erda s = 1 va S = 3 uchlik uchun). Demak, bu o'tish asta-sekin sodir bo'ladi (ms - s oralig'ida). Qorong'ida porlab turgan o'yinchoqlar fosforesansning umrini yanada uzoqroq ko'rsatadi. (Eslatma: Ushbu qo'llanmada flüoresans haqida so'z boradi.)

Ikki qo'zg'alish jarayoni bilan raqobatlashadigan radiatsiyaviy bo'lmagan jarayonlar (masalan, to'qnashuvlar orqali). Raqobatbardosh jarayonlarni hisobga olsak, xona haroratida suyuq eritmalarda fosforesensiya aniqlanmasligi mumkin

Floresan molekulalar odatda xushbo'y, ular UV va ko'rinadigan yorug'lik hududlarida tez so'riladi. Oddiy ftoroforlar - tonik suvda topilgan xinin (to'g'ridan-to'g'ri quyosh nuri ostida bo'lsa, sirtdagi zaif ko'k porlashni kuzating) va flüoresan va rodamin, ko'pincha antifrizga qo'shiladigan ikkita ftorofor. Atomlar odatda lyuminestsent emas, lantanidlar turkumidagi evropiy va terbiy ionlari bundan mustasno. Ushbu maxsus ionlarda erituvchidan himoyalangan f orbitallar o'rtasida elektron o'tishlar sodir bo'lganda, ular floresan hosil qiladi.

Lyuminesansning asosiy elektron o'tishlari Yablonskiy diagrammasi bilan ifodalanishi mumkin.

Shunday qilib, S1 va S2 elektronning yagona asosiy holatiga va birinchi va ikkinchi qo'zg'atilgan elektron holatlariga mos keladi. Har bir elektron holatda 0, 1, 2 tebranishli energiya darajalari mavjud. Bu oddiy diagrammada flüoresan, rezonansli energiya uzatilishi va boshqalar o'chiriladi. Vertikal chiziqlar bilan tasvirlangan o'tishlar bir zumda deb hisoblanadi. Aslida, yadrolar jarayonda harakatlanmasligi uchun taxminan 10-15 soniya vaqt ketadi. Er holati elektroni 0 tebranish darajasida deb hisoblanadi, chunki issiqlik energiyasi uni keyingi tebranish darajasiga ko'tarish uchun etarli emas. Yorug'lik so'rilganda, elektron yuqori darajadagi tebranish darajasiga ko'tariladi. Odatda hayajonlangan elektronlar S1 yoki S2 ning eng past tebranish darajasiga tez (< 1 ps) bo'shashadi. ichki konvertatsiya. Floresan emissiyasi S1 ning eng past tebranish holatidan So ning har qanday tebranish holatigacha sodir bo'lishi mumkin. Demak, chiqarilgan foton so'rilgan fotonga qaraganda energiya jihatidan pastroq (to'lqin uzunligi bo'yicha uzunroq). Ikkala jarayon ham elektronning fotonning yutilishi yoki emissiyasi bilan har xil tebranish darajalariga o'tishini va shu darajadagi nurlanmagan tebranish gevşemesini o'z ichiga olganligi sababli, emissiya spektrlari ko'pincha yutilish spektrlarining ko'zgu tasviri bo'ladi. (Bu shuni anglatadiki, So va S1 tebranish darajalari bir -biriga o'xshash masofada joylashgan. Shu bilan bir qatorda, S1 elektronlari aylanib, T1 holatiga o'tishi mumkin, bu jarayon tizimlararo o'tish deb ataladi va fosforesensiyaga olib keladi.

Floresan nurlanishining xarakteristikalari

  1. Stokes Shift: Emissiya energiyasi yutilish energiyasidan kamroq bo'lib, emissiya to'lqin uzunliklari yutilish to'lqin uzunliklaridan yuqori bo'lishiga olib keladi. (Yuqoridagi tushuntirishga qarang.)
  2. Emissiya spektrlari odatda qo'zg'alish to'lqin uzunligiga bog'liq emas (Kasha qoidasi): Bu qo'zg'aluvchan holatning eng past tebranishli energiya darajasiga tez bo'shashishi tufayli sodir bo'ladi.
  3. Ko'zgu tasviri qoidasidan istisnolar: Og'ishlar qo'zg'aluvchan holat molekulasidagi yadrolar geometriyasining o'zgarishidan kelib chiqadi. Agar S1 holatining ishlash muddati uzoq bo'lsa, bu emissiya oldidan harakatlanish uchun vaqt berilsa sodir bo'lishi mumkin. Bunga sikloheksan tarkibidagi p-terfenil bilan misol keltirish mumkin, bunda halqalar hayajonlangan holatda bir-biriga o'xshash bo'ladi. Qo'zg'alish holatida elektron siljishi bo'lganligi sababli, qo'zg'atilgan florofor va eritmaning boshqa komponenti o'rtasida kompleks paydo bo'lishi mumkin (zaryad o'tkazish kompleksi). Shu bilan bir qatorda, ba'zi floroforlar o'zlari bilan murakkab (piren). U past konsentratsiyalarda (ya'ni komplekslarsiz) yuqori tuzilishga ega emissiya spektrlariga ega, ammo yuqori konsentratsiyalarda hayajonlangan holatdagi dimer yoki emissiya natijasida kelib chiqadigan emissiya spektrlarida o'zgarishlar yuz beradi. eksimer. Akridin har xil pH darajasida ikkita emissiya spektrini ko'rsatadi, bu qo'zg'alish pka o'zgarishidan kelib chiqadi (5.45 dan 10.7 gacha).

Uch xil to'lqin uzunligida floroforning qo'zg'alishi (EX 1, EX 2, EX 3) emissiya profilini o'zgartirmaydi, lekin qo'zg'alish spektrining amplitudasiga mos keladigan floresan emissiya intensivligida (EM 1, EM 2, EM 3) o'zgarishlarni keltirib chiqaradi. Molekulyar zondlar katalogidan rasm, yuqoridagi havola.

Floresan-rezonans energiya uzatish (FRET)

Agar yutuvchi tur qo'zg'atilgan florofor holatiga yaqin bo'lsa va ftorforning emissiya spektrlari ikkinchi turning yutish spektrlari bilan bir-biriga to'g'ri kelsa, ikkita dipolning ulanishi sodir bo'lishi mumkin va energiyaning qo'zg'aluvchan holatidan o'tkazilishi mumkin. florofor (donor D) ikkinchi yutuvchi turga (akseptor A). Energiyaning bunday uzatilishi dipolli ulanish orqali amalga oshiriladi, lekin ajratilgan fotonning arzimas ajralishi va yutilishi orqali emas. Hech qanday foton ishlab chiqarilmaydi. Bu jarayon deyiladi Floresan rezonansli energiya uzatish (FRET). energiya uzatish tezligi, k(r) quyidagicha ifodalanadi:

k (r) = (1/ & tau) (R.o/r) 6 bu erda Ro Forster masofasi, u donor va akseptorning spektral mos kelishining o'lchovidir (buning uchun ko'pchilik biologik makromolekulalar 30-60 angstromga o'xshash qiymatga ega), &tau - FRET yo'qligida donorning umri va r. donor va akseptor orasidagi masofa. Belgilangan masofada bitta donor/akseptor jufti uchun FRET samaradorligi, E:

E = Ro 6 /(R.o 6 + r 6). Bu 1/r 6 ga bog'liq samaradorlikni ko'rsatadi, bu FRETni masofaga juda sezgir qiladi.

Biologik floroforlar

Hamma molekulalar ham flüoresan emas. Biologik molekulalar orasida ba'zilari, ayniqsa, makromolekulalar, floresan ta'sir qiluvchi aromatik o'rnini bosuvchi moddalarni o'z ichiga oladi. Bular deyiladi ichki ftoroforlarva oqsillarga nisbatan triptofan, tirozin va fenilalaninning yon zanjirlarini, aromatik aminokislotalarni o'z ichiga oladi. Triptofanning indol yon zanjiri eng lyuminestsent bo'lib, uning erituvchi sharoitlariga sezgir bo'lgan emissiya spektrlari ko'milganida ko'pincha ko'k rangga, erituvchiga ta'sir qilganda qizil rangga o'tadi. Nuklein kislotalar, garchi ular tarkibida aromatik asoslar bo'lsa ham, kambag'al unforoforlardir. Ko'p biologik molekulalarni ekzogen qo'shilgan ftoroforlar, masalan, floresin izotitsianat, rhodamin izotiyotsant, dansil xlor va boshqalar bilan kovalent modifikatsiyalash orqali (biologik molekuladagi nukleofillar orqali) flurosessent qilish mumkin. Ular deyiladi. tashqi floroforlar. Bularga ds-DNK (etidiy bromidi) yoki lipid membranalari (difenilheksatrien) kabi tuzilmalarga kovalent bo'lmagan tarzda bog'lanadigan molekulalar kiradi. Ba'zi biologik ftoroforlar ferment reaktsiyasi uchun substratdir. Bunga oksidlangan flavinlar (FAD, FMN) va NADning kamaygan shakli (ya'ni NADH) misol bo'la oladi. Foydali floroforning yana bir turi - bu pH yoki [Ca ioni] kabi parametrlarning o'zgarishi bilan floresan xususiyatlari o'zgarib turadigan indikatorlar.

Fluoressensiyadan olingan ma'lumot

Molekulyar tuzilish haqidagi ma'lumotni ko'plab lyuminestsent xususiyatlardan aniqlash mumkin:

  • Emissiya spektridagi Stoks siljishi: Bu siljish qutbli muhitdagi floroforlar uchun eng yaxshisidir (yuqorida aytib o'tilganidek, indolli lyuminestsent uchun. Oqsil denaturatsiyasida o'zgarishlar kuzatilsa, yon zanjirning (ko'milgan yoki sirt) joylashuvi to'g'risida xulosa chiqarish mumkin. eritma, lekin qutbsiz muhitda (oqsil, ikki qavatli yoki lipoproteindagi hidrofobik cho'ntak bilan bog'langan va hokazo) intensiv ravishda floresanlanadi.
  • Söndürme: Bular floroforning mavjudligi haqida ma'lumot berishi mumkin. Misol uchun, ko'milgan tiptofan yoki zond katta qutbli söndürücünün mavjudligida flüoresan intensivligida ozgina o'zgarishlarni ko'rsatadi, sirt triptofan yoki zond esa lyuminestsent intensivligining sezilarli pasayishini ko'rsatadi.
  • Anizotropiya yoki qutblanish: Bular floroforning lyuminestsent muddati davomida aylanish darajasini o'lchaydi. Agar kichkina ftor katta molekulaga bog'lansa, uning aylanish diffuzion konstantasi kamayadi va anizotropiyasi oshadi. Yopishqoqlik aylanish diffuziya tezligini pasaytirganligi sababli, bu o'lchovlardan flüoresansdagi o'zgarishlarni (masalan, ikki qatlam ichida) aniqlash mumkin. Masalan, to'yingan yog 'kislotalari bilan ko'proq boyitilgan membranalar ko'p to'yinmagan yog'li kislotalar bilan boyitilgan ikki qavatdagi xuddi shu zondga nisbatan hidrofobik, lyuminestsent zondning yuqori anizotropiyasini ko'rsatishi kerak.
  • FRET: Bu monomerlar orasidagi bog'lanishni ko'rsatish uchun ishlatilishi mumkin, masalan (agar bitta oqsilda triptofan bo'lsa, ikkinchisida tashqi lyuminestsent zond).

Molekulyar zondlar - ajoyib floroforlar va hujjatlar

  • BioProbes -dan qo'llanma:
    • floresans haqida asosiy tushunchaga ega bo'lish
    • Qo'zg'alish va emissiya spektrlarini qanday izohlashni o'rganing
    • Qo'zg'alish va emissiya filtrlari o'rtasidagi farqni tushunish

    Ushbu bo'limga qo'shilishi mumkin bo'lgan qo'shimcha materiallar:

    3.1 Proteinlarni tozalash

    Proteinlarni tozalash bir yoki bir nechta oqsillarni murakkab aralashmadan, odatda hujayralar, to'qimalar yoki butun organizmlardan ajratish uchun mo'ljallangan bir qator jarayonlar. Proteinni tozalash qiziqish oqsilining funktsiyasi, tuzilishi va o'zaro ta'sirini tavsiflash uchun juda muhimdir.Tozalash jarayoni aralashmaning oqsil va oqsil bo'lmagan qismlarini ajratishi va nihoyat kerakli oqsilni boshqa barcha oqsillardan ajratishi mumkin. Bir oqsilni boshqasidan ajratish odatda oqsillarni tozalashning eng mashaqqatli tomonidir. Ajratish bosqichlari odatda oqsillar hajmi, fizik-kimyoviy xossalari, bog'lanish yaqinligi va biologik faollikdagi farqlardan foydalanadi. Toza natija deb atash mumkin oqsil izolati.

    Proteinlarni tozalash ham shunday tayyorgarlik yoki analitik. Tayyor tozalash keyingi foydalanish uchun nisbatan katta miqdorda tozalangan oqsillarni ishlab chiqarishni maqsad qilgan. Misollar, fermentlar (masalan, laktaza), ozuqaviy oqsillar (masalan, soya oqsili izolati) va ayrim biofarmatsevtik preparatlar (masalan, insulin) kabi tijorat mahsulotlarini tayyorlashni o'z ichiga oladi. Bemorning sog'lig'iga potentsial xavf tug'diradigan uy mahsuloti oqsillari kabi ikkita mahsulotni olib tashlash uchun ko'pincha bir nechta tayyorgarlik bosqichlari qo'llaniladi. Analitik tozalash turli tadqiqot yoki analitik maqsadlarda, jumladan, oqsilning tuzilishini, translatsiyadan keyingi modifikatsiyalarini va funksiyasini aniqlash, miqdoriy aniqlash va o‘rganish uchun nisbatan oz miqdorda oqsil hosil qiladi. Pepsin va üreaz birinchi bo'lib oqsillar bo'lib, ular kristallanishiga qadar tozalangan.

    Ekstraksiya

    Agar qiziqish oqsili organizm tomonidan atrofdagi eritmaga chiqarilmasa, har bir tozalash jarayonining birinchi bosqichi oqsil tarkibidagi hujayralarning buzilishi hisoblanadi. Protein qanchalik mo'rt va hujayralar qanchalik barqaror ekanligiga qarab, masalan, quyidagi usullardan birini qo'llash mumkin: i) takroriy muzlatish va eritish, ii) sonikatsiya, iii) yuqori bosimli gomogenlash (frantsuz matbuoti), iv ) silliqlash (munchoq tegirmoni) va v) yuvish vositalari (masalan, Triton X-100) va/yoki fermentlar (masalan, lizozim) orqali o'tkazuvchanlik. Va nihoyat, oqsillar va boshqa eruvchan birikmalar supernatantda qolishi uchun hujayra qoldiqlari santrifüj orqali olib tashlanishi mumkin.

    Shuningdek, proteazlar hujayra lizisida chiqariladi, ular eritmadagi oqsillarni hazm qilishni boshlaydi. Agar qiziqish oqsili proteolizga sezgir bo'lsa, ovqat hazm qilishni sekinlashtirish uchun tez harakat qilish va ekstrakti sovib turishi tavsiya etiladi. Shu bilan bir qatorda, bir yoki bir nechta proteaz inhibitörleri hujayra buzilishidan oldin lizis buferiga qo'shilishi mumkin. Ba'zida DNK miqdori yuqori bo'lganligi sababli hujayra lizatining yopishqoqligini kamaytirish uchun DNK qo'shish kerak bo'ladi.

    Yog'ingarchilik va differensial eritish

    Oqsillarni ommaviy tozalashda oqsillarni ajratib olishning umumiy birinchi bosqichi ammoniy sulfat (NH) kabi tuz yordamida cho'ktirishdir.4)2SO4. Bu jarayon deyiladi Tuzlash yoki Tuzlash(3.1 -rasm) Bu ammoniy sulfatning ko'p miqdorda qo'shilishi va cho'kma oqsilining turli qismlarini yig'ish yo'li bilan amalga oshiriladi. Ammoniy sulfat ko'pincha ishlatiladi, chunki u suvda yaxshi eriydi, harorat ta'siridan nisbiy erkinlikka ega va odatda ko'pchilik oqsillar uchun zararli emas. Bundan tashqari, ammoniy sulfatni dializ yo'li bilan olib tashlash mumkin (3.2-rasm). Oqsillardagi hidrofobik guruhlar atmosferaga ta'sir qiladi, boshqa oqsilli hidrofobik guruhlarni o'ziga tortadi va yig'iladi. Cho'kilgan oqsillar ko'rinadigan darajada katta bo'ladi. Bu usulning bir afzalligi shundaki, uni juda katta hajmlarda arzon narxda bajarish mumkin.

    3.1 -rasm Tuzlanish va tuzlash. Tuzlash jarayonida tuz molekulalari oqsil molekulalari orasidagi elektrostatik o'zaro ta'sirlarni kamaytirish orqali oqsillarning eruvchanligini oshiradi. Tuz kontsentratsiyasi oshgani sayin, oqsil-oqsil o'zaro ta'siri oqsil-erituvchi ta'siriga qaraganda ancha qulay bo'ladi va oqsillar eritmadan cho'kadi.

    Tozalanadigan birinchi oqsillar suvda eriydigan oqsillardir. Integral membrana oqsillarini tozalash uchun hujayra membranasining buzilishi talab qilinadi, bunda bitta membrana bo'linmasida bo'lgan boshqalardan alohida oqsil ajratiladi. Ba'zida birinchi navbatda ma'lum bir membrana fraktsiyasi ajratilishi mumkin, masalan, mitoxondriyal membranada joylashgan oqsilni tozalashdan oldin hujayralardan mitoxondriyalarni ajratish. Natriy dodesil sulfat (SDS) kabi yuvish vositasi hujayra membranalarini eritish va tozalash jarayonida membrana oqsillarini eritmada saqlash uchun ishlatilishi mumkin, ammo SDS denatürasyona sabab bo'lganligi sababli, Triton X-100 yoki CHAPS kabi yumshoqroq yuvish vositalaridan oqsilning tabiiy tarkibini saqlab qolish uchun foydalanish mumkin. to'liq tozalash paytida konformatsiya.

    3.2-rasm Dializ. Dializ jarayoni erigan molekulalarni hajmiga qarab ajratadi. Biologik namuna yopiq membrana ichiga joylashtiriladi, bu erda qiziqish oqsili membrananing teshiklaridan o'tishi uchun juda katta, lekin undan kichikroq ionlar oson o'tishi mumkin. Eritma muvozanatga kelganda, ionlar butun eritma bo'ylab teng taqsimlanadi, oqsil esa membranada to'planib qoladi. Bu suspenziyaning umumiy tuz konsentratsiyasini pasaytiradi.

    Ultratsentrifugatsiya

    Santrifüj suyuqlikda to'xtatilgan turli massa yoki zichlikdagi zarrachalarning aralashmalarini ajratish uchun markazdan qochma kuch ishlatadigan jarayondir. Bakterial hujayralar kabi oqsillar yoki boshqa zarrachalar aralashmasi bo'lgan idish (odatda naycha yoki shisha) yuqori tezlikda aylantirilganda, har bir zarrachaning inersiyasi zarrachalarning tezligi tomon proportsional bo'lgan kuch beradi. uning massasi. Ushbu kuch tufayli berilgan zarrachaning suyuqlik bo'ylab harakatlanish tendentsiyasi suyuqlikning zarrachaga ko'rsatadigan qarshiligi bilan qoplanadi. Santrifüjdagi namunani & quot; aylantirish & quot; ning aniq ta'siri shundaki, massali, kichik va zich zarralar kamroq massali zarrachalarga yoki suyuqlikda ko'proq & quot; tortish & quot; bo'lgan zarrachalarga qaraganda tezroq tashqariga siljiydi. Zarrachalarning suspenziyalari sentrifugada "espil" bo'lganda, idishning pastki qismida suyuqlikdagi eng katta qarshilikka ega bo'lgan eng massiv zarrachalar uchun boyitilgan "pellet" hosil bo'lishi mumkin.

    Siqilmagan zarralar asosan & quotsupernatant & quot deb nomlangan suyuqlikda qoladi va uni idishdan olib tashlash mumkin, shu bilan pelletdan supernatant ajralib chiqadi. Santrifüj tezligi namunaga nisbatan qo'llaniladigan burchak tezlanishi bilan aniqlanadi, odatda bu ko'rsatkichga nisbatan o'lchanadi g. Agar namunalar etarlicha uzoq santrifüj qilinsa, idishdagi zarralar muvozanatga keladi, bunda zarralar idishning ma'lum bir nuqtasida to'planadi, bu erda ularning ko'tarilish zichligi markazdan qochma kuch bilan muvozanatlanadi. Bunday & quotequ muvozanat & quot tsentrifugatsiyasi ma'lum bir zarrachani keng tozalash imkonini beradi.

    Yilda saxaroza gradiyentli santrifugatsiyaShakarning chiziqli kontsentratsion gradienti (odatda saxaroza, glitserol yoki silika asosidagi zichlik gradyanli muhit, masalan, Perkoll) trubada hosil bo'ladi, shunda eng yuqori kontsentratsiya pastda va pastda tepada bo'ladi. Percoll - GE Healthcare kompaniyalariga tegishli savdo belgisi. Keyin oqsil namunasi gradient ustiga qatlamlanadi va ultratsentrifugada yuqori tezlikda aylantiriladi. Bu og'ir makromolekulalar engilroq materialga qaraganda tezroq naychaning pastki qismiga ko'chishiga olib keladi. Saxaroza bo'lmaganda sentrifugalash jarayonida zarrachalar aylanish markazidan uzoqlashgani sari ko'proq markazdan qochma kuchni boshdan kechiradi (ular qanchalik uzoqroq bo'lsa, shunchalik tez harakatlanadi). Buning muammosi shundaki, idish ichidagi foydali ajratish diapazoni kichik kuzatilishi mumkin bo'lgan oyna bilan cheklangan. To'g'ri ishlab chiqilgan saxaroza gradienti ortib borayotgan markazdan qochish kuchiga qarshi turadi, shuning uchun zarrachalar markazdan qochish maydonida bo'lgan vaqtga mutanosib ravishda harakatlanadi. Ushbu gradientlar bilan ajratilgan namunalar "rate zonal" tsentrifugalar deb ataladi. Protein/zarrachalarni ajratgandan so'ng, gradient fraktsiyalanadi va yig'iladi.

    Shakar 3.3 Saxaroza zichligi gradienti.

    Tepaga qaytish

    Tozalash strategiyasi

    Boshlang'ich materialni tanlash tozalash jarayonini loyihalashning kalitidir. O'simlik yoki hayvonda ma'lum bir oqsil odatda tana bo'ylab bir hil taqsimlanmaydi, turli organlar yoki to'qimalarda oqsilning yuqori yoki past konsentratsiyasi mavjud. Faqat eng yuqori konsentratsiyali to'qimalar yoki organlardan foydalanish ma'lum miqdordagi tozalangan oqsil ishlab chiqarish uchun zarur bo'lgan hajmni kamaytiradi. Agar oqsil kam miqdorda bo'lsa yoki u yuqori qiymatga ega bo'lsa, olimlar kerakli proteinni ko'p miqdorda ishlab chiqaradigan hujayralarni ishlab chiqish uchun rekombinant DNK texnologiyasidan foydalanishlari mumkin (bu ekspression tizim sifatida tanilgan). Rekombinant ifoda oqsilni belgilash imkonini beradi, masalan. tozalashni osonlashtirish uchun His-teg yoki Strep-teg yordamida, zarur bo'lgan tozalash bosqichlarini kamaytiring. Ushbu texnikalar 5 -bobda batafsilroq muhokama qilinadi.

    Analitik tozalash odatda oqsillarni ajratish uchun uchta xususiyatdan foydalanadi. Birinchidan, oqsillarni izoelektrik nuqtalariga ko'ra pH darajali jel yoki ion almashinuvchi kolon orqali o'tkazib tozalash mumkin. Ikkinchidan, oqsillarni kattaligiga yoki molekulyar og'irligiga qarab ajratish xromatografiyasi yoki SDS-PAGE (natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi) yordamida. Proteinlar ko'pincha 2D-PAGE yordamida tozalanadi va keyin oqsil identifikatorini aniqlash uchun peptid massasi barmoq izlari bilan tahlil qilinadi. Bu ilmiy maqsadlar uchun juda foydali va bugungi kunda oqsillarni aniqlash chegaralari juda past va ularni tahlil qilish uchun nanogramm miqdoridagi protein etarli. Uchinchidan, oqsillarni polarlik/hidrofobiklik bilan ajratish mumkin, bu esa yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi yoki teskari fazali xromatografiya yordamida amalga oshiriladi. Jel elektroforez texnikasi 3.2 -bo'limda batafsilroq muhokama qilinadi. Bu bo'limda asosan xromatografik bo'linishlar haqida so'z boradi.

    Preparativ oqsilni tozalash uchun tozalash protokoli odatda bir yoki bir nechta xromatografik bosqichlarni o'z ichiga oladi. Xromatografiyadagi asosiy protsedura oqsilni o'z ichiga olgan eritmani turli materiallar bilan o'ralgan ustun orqali oqishdir. Turli oqsillar ustun materiali bilan har xil ta'sir qiladi va shuning uchun ustundan o'tish uchun zarur bo'lgan vaqt yoki oqsilni ustundan tozalash uchun zarur bo'lgan shartlar bilan ajratilishi mumkin. Odatda oqsillar ustundan chiqib ketayotganda 280 nm da yutilish orqali aniqlanadi. Ko'p turli xil xromatografik usullar mavjud, ularning eng keng tarqalgani quyida tasvirlangan:

    Hajmni istisno qilish xromatografiyasi (jel filtrlash xromatografiyasi deb ham ataladi)

    Xromatografiya yordamida oqsilni eritmada yoki denaturing sharoitida g'ovakli jellar yordamida ajratish mumkin. Ushbu usul o'lchamni istisno qilish xromatografiyasi sifatida tanilgan. Printsip shundaki, kichikroq molekulalar g'ovakli matritsada kattaroq hajmni bosib o'tishlari kerak. Shunday qilib, ma'lum bir o'lchamdagi oqsillar jel ustunining boshqa uchida to'planishidan oldin o'zgaruvchan hajmdagi elyuent (eritma) talab qiladi. Shunday qilib, oqsillar hajmiga qarab ajratiladi (3.4-rasm).

    Proteinni tozalash nuqtai nazaridan, elim har xil probirkalarda to'planadi. Tozalash uchun oqsilning o'lchanadigan izi bo'lmagan barcha sinov naychalari tashlanadi. Qolgan eritma shu tarzda tozalanadigan oqsildan va shunga o'xshash boshqa oqsillardan tayyorlanadi.

    3.4 -rasm. O'lchamlarni istisno qilish xromatografiyasi. Gel filtrlash xromatografiyasi sifatida ham tanilgan, bu past o'lchamli izolyatsiyalash usuli bo'lib, unda har birining aniq o'lchamiga ega mayda va ldquotunnelli quotli boncuklardan foydalaniladi. Hajmi &ldquoexclusion limiti" deb ataladi, ya'ni ma'lum molekulyar og'irlikdan yuqori molekulalar tunnellarga sig'maydi. O'lchamlari istisno chegarasidan kattaroq bo'lgan molekulalar tunnellarga kirmaydi va boncuklar orasidan o'tib ustun orqali nisbatan tez o'tib ketadi. Tunnellarga kira oladigan kichikroq molekulalar shunday yo'l tutishadi va shu tariqa ular ustun orqali o'tadigan uzunroq yo'lga ega bo'lishadi. Shu sababli, istisno chegarasidan kattaroq molekulalar ustunni erta tark etadi, boncuklardan o'tib ketadigan kichikroq molekulalar esa keyinchalik kolondan ajralib chiqadi. Bu usul molekulalarni o'lchamlari bo'yicha ajratish imkonini beradi.

    Hidrofobik o'zaro ta'sir xromatografiyasi (HIC)

    HIC muhiti amfifil bo'lib, ham hidrofobik, ham hidrofilik hududlari bo'lib, oqsillarni sirt hidrofobikligiga qarab ajratish imkonini beradi. Maqsadli oqsillar va ularning mahsulot agregatlari turlicha hidrofob xususiyatlarga ega va ularni HIC orqali olib tashlash, qiziqish oqsilini yanada tozalaydi. Bundan tashqari, ishlatilgan muhit odatda boshqa xromatografiya usullariga qaraganda kamroq denatüratsion sharoitda ishlaydi, shu bilan qiziqish oqsilini tabiiy va funktsional holatida saqlab qolishga yordam beradi. Toza suvda qatronlar va oqsilning hidrofob hududlari o'rtasidagi o'zaro ta'sir juda zaif bo'ladi, lekin bu o'zaro ta'sir yuqori ionli buferli HIC qatroniga oqsil namunasini qo'llash orqali kuchayadi. Keyin buferning ion kuchi hidrofobiklikni pasaytirish tartibida elute oqsillarga kamayadi (3.5-rasm).

    3.5-rasm Gidrofobik o'zaro ta'sir xromatografiyasi. Ko'k rangda ko'rsatilgan ustun matritsasi kovalent tarzda biriktirilgan hidrofobik ligandga ega. Yuqori tuz sharoitida oqsillar matritsaga har xil yaqinlik bilan bog'lanadi, ko'proq hidrofob oqsillar (sariq rangda ko'rsatilgan) ko'proq hidrofil oqsillarga (yashil rangda ko'rsatilgan) nisbatan qattiqroq bog'lanadi. birinchi bo'lib chiqariladi, so'ngra ko'proq hidrofob oqsillar.

    Ion almashinuvi xromatografiyasi

    Ion almashinuvi xromatografiyasi birikmalarni ion zaryadining tabiati va darajasiga ko'ra ajratadi. Foydalanadigan ustun uning turiga va zaryad kuchiga qarab tanlanadi. Anion almashinadigan smolalar musbat zaryadga ega bo‘lib, manfiy zaryadlangan birikmalarni (anionlarni) ushlab turish va ajratish uchun, kation almashinuvchi smolalar esa manfiy zaryadga ega bo‘lib, musbat zaryadlangan molekulalarni (kationlar) ajratish uchun ishlatiladi.

    Ajratish boshlanishidan oldin qarama-qarshi zaryadlangan ionlarni muvozanatlash uchun ustun orqali bufer pompalanadi. Namuna yuborilganda, erigan molekulalar bufer ionlari bilan almashadilar, chunki ularning har biri qatronlar bilan bog'lanish joylari uchun kurashadi. Har bir erigan moddaning ushlab turish muddati uning zaryadining kuchiga bog'liq. Birinchidan, eng zaif zaryadlangan birikmalar, keyin esa zaryadlari ketma -ket kuchliroq bo'ladi. Ajratish mexanizmining tabiati tufayli pH, bufer turi, bufer konsentratsiyasi va harorat ajratishni boshqarishda muhim rol o'ynaydi.

    3.6 -rasmda a deb nomlanuvchi ion almashinuvchi ustun turi ko'rsatilgan kation almashinuv ustuni. Bunday holda, tayanch mayda boncuklardan iborat bo'lib, ularga zaryadga ega kimyoviy biriktirilgan. Har bir zaryadlangan molekulada qarshi ion mavjud. Rasmda manfiy zaryadlangan guruhlar (qizil) biriktirilgan boncuklar (ko'k) ko'rsatilgan. Bu misolda qarshi-ion natriy bo'lib, u musbat zaryadlangan. Salbiy zaryadlangan guruhlar, kovalent biriktirilishi tufayli, boncuklarni tashlab keta olmaydi, lekin bir xil zaryadli molekulalar uchun qarshi ionlarni & ldquo almashish mumkin. Shunday qilib, kation almashinuvi ustunimusbat zaryadlangan qarama-ionlar va musbat zaryadli birikmalar bo'ladi, ular kolondan o'tib, aks ionlar bilan almashadilar va munchoqlardagi manfiy zaryadlangan guruhlarga & ldquostick & quot; Neytral yoki manfiy zaryadlangan namunadagi molekulalar tez ustundan o'tadi. Boshqa tomondan, ichida anion almashinish xromatografiyasi, munchoqlarga biriktirilgan kimyoviy guruhlar musbat zaryadlangan va qarshi ionlar manfiy zaryadlangan. Namunadagi manfiy zaryadlangan molekulalar tez o'tib ketadi va boshqa molekulalar tez o'tadi. & Ldquostuck & quot molekulalarini ustunga olib tashlash uchun ularni almashtirish va bo'shatish uchun kerakli miqdordagi tegishli ionlarning yuqori konsentratsiyasini qo'shish kifoya. Bu usul aralashmaning bir xil zaryadga ega bo'lgan barcha tarkibiy qismlarini qayta tiklashga imkon beradi.

    Ion almashinuvi xromatografiyasi oqsillarni tozalashda foydalanish uchun juda kuchli vosita bo'lib, tez-tez ham analitik, ham preparativ ajratishda qo'llaniladi.

    3.6-rasm Kation almashinuvi xromatografiyasi. Ushbu diagrammada manfiy zaryadlangan molekulalar (qizil rangda ko'rsatilgan) ustun matritsali boncuklarga (ko'k rangda ko'rsatilgan) kovalent tarzda biriktirilgan. Natriy ionlari (Na+) - bu oqsil aralashmasi ichida musbat zaryadlangan oqsillar bilan almashtiriladigan qarshi ionlar. Neytral va manfiy zaryadlangan oqsillar yopishmaydi va ustun orqali o'tadi. Keyin musbat zaryadlangan oqsillarni ustun ionidan yuqori konsentratsiyali ionlarni (bu holda natriy ionlari) qo'shib, ajratish mumkin.

    Affinity xromatografiyasi - bu molekulyar konformatsiyaga asoslangan ajratish usuli bo'lib, u tez -tez qo'llaniladigan maxsus qatronlardan foydalanadi. Ushbu qatronlar o'zlarining sirtlariga biriktirilgan ligandlarga (kichik molekulalar) ega bo'lib, ular ajratilishi kerak bo'lgan birikmalar uchun xosdir va ular bilan bog'lanadi. Ko'pincha, bu ligandlar antikor-antigen o'zaro ta'siriga o'xshash tarzda ishlaydi. Ligand va uning maqsadli birikmasi orasidagi bu & quotlock va kalit & quot mosligi uni juda aniq qiladi, tez -tez bitta cho'qqini hosil qiladi, namunadagi hamma narsa saqlanmagan (3.7 -rasm).

    Masalan, ko'plab membrana oqsillari glikoproteinlar bo'lib, lektinga yaqinlik xromatografiyasi yordamida tozalanishi mumkin. Kir yuvish vositasida eriydigan oqsillarni kovalent biriktirilgan lektinga ega bo'lgan modifikatsiyalangan xromatografiya qatroniga bog'lashga ruxsat berilishi mumkin. Lektin bilan bog'lanmaydigan oqsillar yuviladi va keyin maxsus bog'langan glikoproteinlar lektinni bog'lash joyida bog'langan glikoproteinlar bilan raqobatlashadigan yuqori konsentratsiyali shakar qo'shilishi mumkin. Ba'zi lektinlar glikoproteinlarning oligosaxaridlari bilan yuqori darajada bog'lanadi, ular shakar bilan raqobatlasha olmaydi va bog'langan glikoproteinlar lektinni denatürasyon yo'li bilan chiqarilishi kerak.

    3.7 -rasm Affinity xromatografiyasiga misol. Bu misolda, P1 oqsilining Z ligandiga yaqinligi bor va u ustun bilan bog'lanadi, P2 va P3 oqsillari esa ustun orqali o'tadi. Protein P1 yuqori konsentratsiyali Z ligand yordamida kolondan chiqarilishi mumkin.

    Umumiy texnika rekombinant oqsilning N- yoki C-terminaliga 6 dan 8 gacha histidin qoldiqlari ketma-ketligini yaratishni o'z ichiga oladi. Polihistidin nikel va kobalt kabi ikki valentli metall ionlari bilan kuchli bog'lanadi. Proteinni polixistidin tegini bog'laydigan, harakatsiz nikel ionlari bo'lgan ustun orqali o'tkazish mumkin. Barcha belgilanmagan oqsillar ustun orqali o'tadi. Proteinni imidazol bilan suyultirish mumkin, u ustun bilan bog'lanish uchun polixistidin yorlig'i bilan raqobatlashadi yoki qatronga tegning yaqinligini kamaytiradigan pH (odatda 4,5 gacha) kamayadi. Bu protsedura, odatda, muhandislik tegiga ega bo'lgan rekombinant oqsillarni tozalashda ishlatilganda (masalan, 6xHis yorlig'i), uni ikki valentli kationlarga xos bo'lgan tabiiy oqsillar uchun ham ishlatish mumkin.

    Immunoaffinlik xromatografiyasi

    Yaqinlik xromatografiyasining maxsus turi - immunoaffinlik xromatografiyasi (3.8-rasm).Bu usul qiziqish oqsilini tozalash uchun antikorni o'ziga xos antijeni bilan (antikor tanlab bog'laydigan maqsadli molekula) qo'llaydi. Protsedura antikorni qattiq substratga (masalan, gözenekli boncuk yoki membrana) immobilizatsiya qilishni o'z ichiga oladi, so'ngra tanlab maqsadni bog'lab qo'yadi, qolgan hamma narsa oqadi. Maqsadli oqsilni pH yoki sho'rlanish darajasini o'zgartirish orqali elit qilish mumkin. Immobilizatsiyalangan ligand antikor bo'lishi mumkin (masalan, Immunoglobulin G) yoki u protein (masalan, A oqsili) bo'lishi mumkin. Chunki bu usul tegda muhandislikni o'z ichiga olmaydi, uni tabiiy manbalardan oqsillar uchun ishlatish mumkin. Antikorlarning tuzilishi va ularning oqsillarni aniqlashda ishlatilishi 3.2 -bo'limda batafsilroq muhokama qilinadi.

    3.8-rasm. Antigen immunoprecipitatsiyasi tajribasi. Antikor qattiq tayanchga oldindan immobilizatsiya qilinadi (chapda) yoki namuna bilan inkubatsiyadan so'ng (o'ngda) antikorlarni bog'laydigan oqsillar yordamida immobilizatsiya qilinadi. Immobilizatsiya immunitet kompleksini murakkab namunadan ajratib olish, yuvish va tozalash orqali oqsilni yuqori darajada boyitilishini ta'minlaydi.

    Tepaga qaytish

    Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) va tez oqsilli suyuqlik xromatografiyasi (FPLC)

    Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi yoki yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasi (HPLC)Erigan moddalarni kolondan tezroq haydash uchun yuqori bosim o'tkazadigan xromatografiya shakli. Bu diffuziya cheklanganligini va piksellar sonini yaxshilashni anglatadi. Eng keng tarqalgan shakli bu "teskari faza" HPLC bo'lib, bu erda ustun materiali hidrofobikdir. Proteinlar suv gradienti va ortib borayotgan organik erituvchi, masalan, asetonitril bilan elutsiya qilinadi. Oqsillar hidrofobikligiga qarab elimatsiyalanadi. HPLC tomonidan tozalangandan so'ng, oqsil faqat uchuvchi birikmalarni o'z ichiga olgan eritmada bo'ladi va osongina bo'lishi mumkin liyofilizatsiyalangan (muzlatilgan holda quritiladi). HPLCni tozalash ko'pincha tozalangan oqsillarning denatüratsiyasiga olib keladi va shuning uchun o'z-o'zidan qayta tiklanmaydigan oqsillarga nisbatan qo'llanilmaydi.

    HPLC -ning kamchiliklari tufayli past bosimli tizimdan foydalanadigan muqobil texnika ishlab chiqilgan va u shunday nomlangan Tez oqsilli suyuq xromatografiya (FPLC). FPLC ko'pincha oqsillar aralashmalarini tahlil qilish yoki tozalash uchun ishlatiladigan suyuq xromatografiya shaklidir. Xromatografiyaning boshqa shakllarida bo'lgani kabi, ajratish mumkin, chunki aralashmaning turli tarkibiy qismlari ikkita materialga, harakatlanuvchi suyuqlikka ("mobil faza") va gözenekli qattiq (turg'un fazaga) har xil yaqinlik xususiyatlariga ega. FPLC da mobil faza suvli eritma yoki "bufer". Bufer oqimi tezligi musbat joy almashinadigan nasos tomonidan boshqariladi va odatda doimiy saqlanadi, bufer tarkibi ikki yoki undan ortiq tashqi rezervuarlardan turli nisbatlarda suyuqliklarni tortib olish orqali o'zgartirilishi mumkin. Statsionar faza silindrsimon shisha yoki plastik ustunga qadoqlangan, odatda, o'zaro bog'langan agarozdan tashkil topgan boncuklardan tashkil topgan qatrondir. FPLC qatronlari qo'llanilishiga qarab boncuk o'lchamlari va sirt ligandlarining keng assortimentida mavjud.

    Eng keng tarqalgan FPLC strategiyasida odatda ion almashinadigan qatronlar tanlanadi (3.9 -rasm). Bir yoki bir nechta qiziquvchan oqsillarni o'z ichiga olgan aralash 100% bufer A da eritiladi va kolonka ichiga quyiladi. Qiziqarli oqsillar qatron bilan bog'lanadi, boshqa komponentlar esa buferda o'tkaziladi. Buferning umumiy oqim tezligi bir xilda saqlanadi, shu bilan birga, konsentratsiyaning dasturlashtirilgan o'zgarishiga (& quotgradient & quot) muvofiq, B tamponining ulushi asta -sekin 0% dan 100% gacha ko'tariladi. B buferida almashtiruvchi ionning yuqori konsentratsiyasi mavjud. Shunday qilib, bufer B kontsentratsiyasi asta-sekin o'sib borishi bilan bog'langan oqsillar ustun matritsasi bilan ionli o'zaro ta'siriga qarab dissotsiatsiyalanadi va eluantda paydo bo'ladi. Eluant tuz kontsentratsiyasini (o'tkazuvchanlik bo'yicha) va oqsil konsentratsiyasini (to'lqin uzunligining 280nm ultrabinafsha nurlarini yutish yo'li bilan) o'lchaydigan ikkita detektor orqali o'tadi. Har bir oqsil elin qilinganida, u oqsil tarkibida oqsil kontsentratsiyasida & quot; tepa & quot; ko'rinishida paydo bo'ladi va undan keyin foydalanish uchun to'planishi mumkin.

    FPLC 1982 yilda Pharmacia tomonidan Shvetsiyada ishlab chiqilgan va sotilgan va dastlab shunday nomlangan tez ishlaydigan suyuq xromatografiya uni HPLC yoki yuqori samarali suyuq xromatografiyadan farq qilish. FPLC odatda faqat oqsillarga nisbatan qo'llaniladi, ammo qatronlar va tamponlarning keng tanlovi tufayli u keng qo'llanilishiga ega. HPLC-dan farqli o'laroq, bufer bosimi nisbatan past, odatda 5 bardan kam, lekin oqim tezligi nisbatan yuqori, odatda 1-5 ml/min. FPLC umumiy hajmi 5 ml yoki undan kam bo'lgan ustunlardagi milligramm aralashmalarni tahlil qilishdan ko'p litr hajmli ustunlarda kilogramm tozalangan oqsilni sanoat ishlab chiqarishgacha osonlik bilan o'lchab qo'yilishi mumkin.

    3.9 -rasm. Odatda FPLC tizimi. A. Xromatografiya tizimi uchun asosiy komponentlar sxemasi va tipik oqim yo‘li. B. GE Healthcare AKTA FPLC apparati Pikrui.

    Tozalash sxemasi

    Proteinni tozalash jarayonida qancha protein tozalanganligini, oqsilning asl aralashmasidan qanday konsentratsiyani, tozalangan oqsilning biologik faolligini va oqsilning umumiy tozaligini aniqlash uchun miqdoriy tizimga ega bo'lish zarur. Bu ishlab chiqilayotgan tozalash usulini boshqarish va optimallashtirishga yordam beradi. Samarasiz ajratish usullarini e'tiborsiz qoldirib, yuqori hosil beradigan yoki oqsilning biologik faolligini saqlaydigan boshqa usullarni qo'llash mumkin.

    Shunday qilib, tozalash sxemasidagi har bir qadam quyidagi parametrlar bo'yicha miqdoriy baholanadi: umumiy oqsil, umumiy faollik, o'ziga xos faollik, hosil, tozalash darajasi. Bu parametrlarning har biri quyida keltirilgan namunaviy protokol doirasida aniqlanadi.

    Siz o'zingizni yangi, noma'lum oqsilni bakteriyalar madaniyatidan ajratmoqchi bo'lgan tadqiqotchidek tasavvur qiling. Siz 500 ml bakteriyalarni bir kechada 37 ° C da o'stirasiz va bakteriyalarni santrifüjlash orqali yig'ib olasiz. Siz madaniyatli bulonni olib tashlaysiz va bakterial pelletni saqlaysiz. Siz bakteriyalarni 10 ml reaktsiya tamponida muzlatish/eritish yordamida lizizlaysiz. Siz erimaydigan materiallarni olib tashlash va eriydigan oqsillarni o'z ichiga olgan supernatentni saqlab qolish uchun lysis bakteriyalarini santrifüjdan o'tkazasiz. Sizning qiziqqan oqsilingiz biologik faollikka ega, siz uni reaktsiya aralashmasida rang o'zgarishiga olib keladigan oddiy tahlil yordamida o'lchashingiz mumkin (3.10 -rasm). Siz shuni ham ta'kidlaysizki, bu reaktsiya tezligi oqsilning yuqori konsentratsiyasi oshishi bilan ortadi (3.10 -rasm).

    3.10 -rasm. Rangni to'q sariqdan jigar ranggacha o'zgarishiga olib keladigan kimyoviy reaktsiya misoli.

    Bu vaqtda siz birinchi konsentratsiyani birinchi tozalash darajasida o'lchashingiz mumkin (bakterial lizis va erimaydigan oqsillarni va boshqa hujayra qoldiqlarini santrifüj orqali olib tashlash).

    Umumiy protein Sizning namunangizning bir qismidagi konsentratsiyani o'lchab, keyin uni namunangizning umumiy hajmiga ko'paytirish orqali hisoblanadi. Bunday holda, siz 10 ml supernatentdan boshlaysiz. Protein kontsentratsiyasini o'lchash uchun odatdagi tahlilda siz oqsil konsentratsiyasini aniqlash uchun 50-200 va 200 ml namunadan foydalanasiz. Misol uchun, agar siz dastlabki tahlilda 7,5 va mug/& ml borligini hisoblasangiz, bu qiymatni mg/ml ga aylantirishingiz kerak va keyin 10 ml supernatantdagi 75 mg oqsil uchun uni 10 ml ga ko'paytiring. 3.1 -jadval)

    Jami faolliknamunadagi umumiy hajmga ko'paytirilib, tahlil ichidagi ferment faolligi sifatida o'lchanadi. Masalan, dastlabki namunada siz biologik reaktsiyangizda 5 dan 50 ml gacha namuna ishlatishingiz mumkin (3.10 -rasm). Agar siz tahlilingizdagi faollikni 2,5 birlik/ml deb hisoblasangiz, bu 2500 birlik/ml yoki 25000 birlik/10 ml supernatantga teng bo'ladi. E'tibor bering, ferment birligi, yoki fermentning xalqaro birligi (belgi U, ba'zan IU ham) a birlik ferment katalizatori faoliyat. 1 U (&mumol/min) tahlil usulining belgilangan sharoitlarida daqiqada bir mikromol substratning konversiyasini katalizlovchi ferment miqdori sifatida aniqlanadi.

    Maxsus faoliyatUmumiy faollikni umumiy oqsilga bo'lish yo'li bilan o'lchanadi. Bizning misolimizda 25000 birlik 75 mg oqsilga = 333,3 birlik/mg ga bo'lingan.

    Yo'l bering har bir tozalash bosqichidan keyin namunada saqlanadigan biologik faollik o'lchovidir. Birinchi bosqichdagi summa 100%qilib belgilanadi. Hamma hosilning keyingi bosqichlari birinchi tozalash bosqichi yordamida baholanadi. U joriy qadamning umumiy faolligini birinchi qadamning umumiy faolligiga bo'lish va keyin 100 ga ko'paytirish yo'li bilan hisoblanadi.

    Tozalash darajasihar bir tozalash bosqichidan keyin hisoblangan ma'lum faollikni birinchi tozalash bosqichining o'ziga xos faolligiga bo'lish orqali qiziqish oqsilining tozaligini baholaydi. Shunday qilib, birinchi qadam har doim 1 qiymatiga ega.

    3.1 -jadval. Proteinlarni tozalashning odatiy sxemasi

    E'tibor bering, har bir tozalash bosqichidan keyin Umumiy protein pastga tushadi, chunki siz oqsilingizni aralashmadagi boshqa oqsillardan tozalayapsiz. Jami faollik shuningdek, har bir tozalash bosqichida pasayadi, chunki har bir tozalash bosqichida sizni qiziqtirgan oqsilning bir qismi ham yo'qoladi, chunki (1) ba'zi oqsillar probirkalar va shisha idishlarga yopishib qoladi, (2) ba'zi oqsillar 100% bilan bog'lanmaydi. Sizning ustun matritsangizning samaradorligi, (3) ba'zi oqsillar elutsiyada ustun matritsasidan chiqarilishi uchun juda qattiq bog'lanishi mumkin va (4) tozalash jarayonida ba'zi oqsillar denaturatsiyalanishi yoki parchalanishi mumkin.

    Yo'qotilgan sizni qiziqtirgan protein miqdori umumiy hajmda ifodalanadi foizli hosilhar bir tozalash bosqichi uchun. Agar foizli hosil juda past muqobil tozalash usullarini o'rganish kerak.

    E'tibor bering, yaxshi oqsillarni tozalash sxemasida muayyan faoliyat Har bir tozalash darajasi bilan sezilarli darajada oshishi kerak, chunki sizni qiziqtirgan protein miqdori ushbu fraktsiyadagi umumiy proteinning katta qismini tashkil qiladi. Agar tozalash bosqichida o'ziga xos faollik ozgina oshsa yoki tozalash bosqichida pasaysa, bu (1) ushbu bosqichda sizni qiziqtirgan protein sezilarli darajada yo'qolganligini, (2) sizni qiziqtirgan proteinning yo'qolishini ko'rsatishi mumkin. denatura yoki degradatsiyaga uchragan va endi biologik faol emas, yoki (3) tozalash bosqichida kerakli kofaktor yoki bog'lovchi oqsil kamayadi. Sabablarning qaysi biri ustunligini aniqlash uchun qo'shimcha tajribalar o'tkazish kerak bo'lishi mumkin, shuning uchun oqsillarni inaktivatsiyasini kamaytirish choralarini ko'rish mumkin. Masalan, ko'plab oqsillar haroratga sezgir va xona haroratida parchalanadi yoki denatüratsiyalanadi. Muz ustida tozalash bosqichlarini bajarish ko'pincha degradatsiyani kamaytirishi mumkin.

    Umuman olganda, o'sish ko'payadi tozalash darajasi tozalash jarayonida eksponent ravishda oshishi kerak. E'tibor bering, bizning misolimizda, agar 4 bosqichli tozalashdan so'ng oqsillarimiz 95% toza bo'lsa, bu bizning qiziqishimiz oqsilini namuna ichidagi umumiy oqsilning taxminan 1,24% ni tashkil qiladi.

    Tepaga qaytish

    3.2 Proteinni aniqlash va vizualizatsiya qilish

    Aralash tarkibidagi qiziqish oqsilini ijobiy aniqlash yoki vizualizatsiya qilish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan analitik usullar, shuningdek, oqsilning biologik faolligi va tirik tizimdagi ahamiyatini tushunishning qimmatli vositasi bo'lishi mumkin, shuningdek, oqsillarni tozalash sxemalarini boshqarishda yordam berishi mumkin.

    Jel elektroforez

    Agaroza dengiz o'tlaridan olingan tabiiy chiziqli polimer bo'lib, buferda qizdirilganda vodorod bog'lash orqali gel matritsasini hosil qiladi va sovutish uchun ruxsat etiladi. Ko'pgina ilovalar uchun faqat bitta komponentli agaroza kerak bo'ladi va polimerizatsiya katalizatorlari talab qilinmaydi (3.11-rasm). Shuning uchun agarozli jellar oddiy va tez tayyorlanadi. Ular mo''tadil va katta o'lchamdagi nuklein kislotalarni ajratish uchun eng mashhur vosita bo'lib, ularni ajratish diapazoni keng, lekin hal qilish kuchi nisbatan past, chunki jellarda hosil bo'lgan tasmalar loyqa va bir-biridan tarqalib ketadi. Bu teshik hajmining natijasidir va uni nazorat qilib bo'lmaydi. Elektroforez uchun agarozli jellardan foydalanishning bu va boshqa afzalliklari va kamchiliklari 3.2 -jadvalda keltirilgan. Agaroz jellari odatda oqsil namunalari uchun ishlatilmaydi va bu bobda bundan keyin muhokama qilinmaydi. Biroq, ular nuklein kislotasi texnikasini qamrab oluvchi 5 -bobda qayta ko'rib chiqiladi.

    3.2-jadval. Agaroz gel elektroforezining afzalliklari va kamchiliklari.

    Poliakrilamid jellari akrilamidni o'zaro bog'lash agenti, odatda N, N& rsquo-metilenbisakrilamid bilan polimerizatsiya qilish natijasida hosil bo'lgan kimyoviy o'zaro bog'langan jellardir (3.11-rasm). Reaktsiya erkin radikal polimerizatsiya bo'lib, odatda tashabbuskor sifatida ammoniy persulfat va katalizator sifatida N, N, N & rsquo, N rsquo-tetrametiletilendiamin (TEMED) bilan amalga oshiriladi. Garchi jellarni tayyorlash va ishlov berish ancha qiyin bo'lsa -da, agarozli jellarga qaraganda tayyorlash uchun ko'proq vaqt talab etiladi, lekin agarozli jellarga nisbatan katta afzalliklarga ega. Ular kattaroq hal qilish kuchiga ega, katta hajmdagi namuna olish qobiliyatini yo'qotmasdan va poliakrilamid jellaridan olingan namunaning tozaligi juda yuqori. Bundan tashqari, poliakrilamid jellarining gözenek hajmini ikki monomer kontsentratsiyasini o'zgartirish orqali oson va boshqariladigan tarzda o'zgartirish mumkin. Shunday qilib, u odatda oqsillarni va DNKning kichik bo'laklarini ajratish uchun ishlatiladi. Shuni ta'kidlash kerakki, poliakrilamid neyrotoksindir (polimerizatsiya qilinmaganda), ammo to'g'ri laboratoriya yordami bilan u tez-tez ishlatiladigan turli xil kimyoviy moddalardan ko'ra xavfli emas. Elektroforez uchun poliakrilamid jellarini ishlatishning ba'zi afzalliklari va kamchiliklari 3.3 -jadvalda tasvirlangan.

    3.3 -jadval. Poliakrilamid gel elektroforezining afzalliklari va kamchiliklari.

    Gidratlangan jel tarmoqlari elektroforez uchun juda ko'p kerakli xususiyatlarga ega. Ular plastinka jellarida gorizontal/vertikal elektroforez yoki naychalar yoki kapillyarlarda elektroforez kabi mexanik jihatdan barqaror eksperimental formatlarning xilma -xilligiga imkon beradi. Mexanik barqarorlik, shuningdek, elektroforetik manipulyatsiyani osonlashtiradi, masalan, jel-bo'laklarda hazm bo'lmagan oqsillarni yoki elektroellyusiya yoki mass-spektral identifikatsiyalash /barmoq bosimi kabi keyingi tajribalarni o'tkazish mumkin. Biokimyoda ishlatiladigan jellar kimyoviy jihatdan juda reaktiv bo'lganligi sababli, ular elektroforez paytida biomolekulalar bilan minimal darajada o'zaro ta'sir qiladi, bu esa namuna komponentlari orasidagi kimyoviy emas, fizik farqlarga asoslangan holda ajratish imkonini beradi.

    3.11-rasm Elektroforezda tez-tez ishlatiladigan jellar. (A) Agaroz agarbiyozdan tashkil topgan, (B) Akrilamid va bisakrilamidning polimerizatsiyasi natijasida poliakrilamid jeli hosil bo'ladi. Polimerlanish reaksiyasi persulfat radikallari tomonidan boshlanadi va TEMED tomonidan katalizlanadi.

    Poliakrilamid matritsali oqsillarning jel elektroforezi, odatda deyiladi poliakrilamid gel elektroforezi (PAGE)shubhasiz, murakkab oqsil aralashmalarini tavsiflashda eng ko'p qo'llaniladigan usullardan biridir. Bu qulay, tez va arzon usul, chunki ular faqat mikrogram miqdordagi proteinni talab qiladi.

    Agar ular izoelektrik nuqtadan farq qiladigan pHga ega bo'lgan muhitda bo'lsa va shuning uchun elektr maydoniga tushganda harakat qilish qobiliyatiga ega bo'lsa, oqsillar aniq elektr zaryadiga ega. Migratsiya tezligi oqsil zaryadlari va uning massasi o'rtasidagi nisbatga mutanosibdir. Massa birligi uchun zaryad qanchalik yuqori bo'lsa, migratsiya tezroq bo'ladi.

    Proteinlar nuklein kislotalari kabi oldindan aytib bo'ladigan tuzilishga ega emas va shuning uchun ularning migratsiya tezligi bir -biriga o'xshamaydi. Bundan tashqari, tizimning pH qiymati izoelektrik nuqta bilan bir xil bo'lsa, ular elektromotor kuchni qo'llashda ko'chib o'tmaydi. Ushbu uslubda ishlaydigan PAGE jellari deyiladi Native PAGE, oqsillar hali ham o'z holatida o'ralgan holda topilgan in vivo. Bunday holda, oqsillar o'zlarining zaryadiga, hajmiga va shakliga qarab ko'chib o'tadilar.

    Shu bilan bir qatorda, oqsillarni elektroforezdan oldin denatüratsiya qilish mumkin. Proteinlarni denatüratsiya qilishning eng keng tarqalgan usuli natriy dodesil sulfat (SDS) kabi yuvish vositasini qo'shishdir. Bu nafaqat oqsillarni denaturatsiyalaydi, balki oqsilni manfiy zaryad bilan qoplaydi, shuning uchun barcha oqsillar elektr maydoniga joylashganda musbat qo'rg'oshinga qarab yuguradi. Ushbu turdagi elektroforez deyiladi SDS-PAGE va oqsillarni faqat molekulyar og'irligiga qarab ajratadi. SDS - bu disulfid aloqalarini buzadigan, oqsilni o'zining kichik birliklariga ajratadigan va shuningdek, ularning o'lchamiga to'g'ridan-to'g'ri jel orqali ko'chib o'tishga imkon beruvchi aniq manfiy zaryadni beruvchi qaytaruvchi vositadir. Bundan tashqari, denaturatsiya ularning uchinchi tuzilishini yo'qotishiga olib keladi va shuning uchun migratsiya tezligi uchinchi tuzilishga emas, balki hajmiga mutanosibdir.

    Jellarda oqsillarni aniqlash

    Poliakrilamid jeli bilan ajratilgan oqsillarni turli usullar bilan aniqlash mumkin, masalan, bo'yoqlar va kumush bo'yash (3.12 -rasm).

    Coomassie ko'k rangi 0,2 dan 0,6 mikrogramgacha proteinni aniqlash imkonini beradi va 15 dan 20 mikrogramgacha miqdoriy (chiziqli) bo'ladi. U tez-tez metanol-sirka kislota eritmalarida ishlatiladi va izopropanol-sirka kislotasi eritmalarida rangsizlanadi (1-rasm A). 2-DE jellarini bo'yash uchun amfolitlarni bo'yoqqa trikloroasetik (TCA) qo'shib olib tashlash va keyinchalik sirka kislotasi bilan rangini o'zgartirish tavsiya etiladi.

    Bu muntazam bo'yash uchun protein jellariga (shuningdek, nuklein kislotalar va lipopolisakkaridlarga) muqobildir, chunki uni ishlatish qulayligi va yuqori sezuvchanligi (Coomassie ko'k bo'yog'idan 50 dan 100 baravar sezgir) (1-rasm B). Bu binoni texnikasi, ayniqsa, ikki o'lchovli jellarga mos keladi.

    Avtoradiografiya - bu radioaktiv zarrachalarga yoki oraliq molekula ishlab chiqaradigan nurga sezgir fotografik emulsiyalardan foydalanadigan radioaktiv yorliqli molekulalarni aniqlash usuli. Kumush o'z ichiga olgan emulsiya zarracha nurlanishiga (alfa, beta) yoki elektromagnit nurlanishga (gamma, yorug'lik) sezgir, shuning uchun u metall kumush bo'lib cho'kadi. Emulsiya radioaktiv oqsillar aniqlangan hududda qorong'i cho'kmalar shaklida rivojlanadi.

    3.12 -rasm. SDS-PAGE. Proteinlar SDS-PAGEda ajratilgan va Coomassie blue (A) va kumush binoni (B) bilan aniqlangan. Molekulyar og'irlikni bilish uchun oqsillar standartlari ham qirralarga yuklanadi.

    Izoelektrik fokuslash

    Bu usul pH gradyanidagi molekulalarning harakatiga asoslangan. Aminokislotalar va oqsillar kabi amfoter molekulalar potentsial va pH gradienti farqi mavjud bo'lgan muhitda ajratiladi. Anod (+) hududi kislotali, katod (-) ishqoriy. Ularning orasidagi pH gradyani shunday bo'ladiki, ajratiladigan molekulalar o'z izoelektrik nuqtalari oralig'ida bo'ladi. Dastlab pH i izoelektrik nuqtasidan past bo'lgan hududlarda joylashgan moddalar musbat zaryadlangan bo'lib, katod tomon ko'chib o'tadi, pH si pI dan past bo'lgan muhitda bo'lganlar esa manfiy zaryadga ega bo'lib, anod tomon ko'chib o'tadi (3.13-rasm).Migratsiya pH uning pI ga to'g'ri keladigan, nol aniq zaryadga ega bo'lgan mintaqaga olib keladi (zwitterionlarni hosil qiladi) va to'xtaydi. Shunday qilib, amfoter molekulalar pI pH bilan mos keladigan tor tasmalarda joylashgan. Ushbu texnikada qo'llash nuqtasi muhim emas, chunki molekulalar doimo o'zlarining pI mintaqasiga o'tadilar. Elektrodlar orasidagi barqaror pH gradientiga pI oldindan belgilangan pH diapazonini qamrab oladigan past molekulyar og'irlikdagi amfolitlar aralashmasi yordamida erishiladi.

    3.13-rasm. Izoelektrik fokuslash. Namunani yuklashdan oldin jelda pH gradienti o'rnatiladi. Namuna yuklangandan so'ng kuchlanish qo'llaniladi. Protein ularning aniq zaryadga ega bo'lmagan izoelektrik pH darajasiga o'tadi.

    Ikki o'lchovli jel elektroforez

    Ikki o'lchovli gel elektroforezi (2-DE) oqsillar aralashmasini ikkita molekulyar xususiyatga ko'ra, har bir o'lchamda bittadan ajratishga asoslangan. Eng ko'p ishlatiladigan birinchi o'lchovni izoelektrik fokuslash va ikkinchi o'lchovni molekulyar og'irligi bo'yicha SDS-PAGE bo'yicha ajratishga asoslangan (3.14-rasm).

    2-DE tajribasida umumiy ish oqimi quyidagicha bo'ladi:

    Namuna tayyorlash usuli tadqiqot maqsadiga bog'liq va tajribaning muvaffaqiyati uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega. Qiziqarli oqsillarning eruvchanligi, hajmi, zaryadi va izoelektrik nuqtasi (pI) kabi omillar namunani tayyorlashga kiradi. Namuna tayyorlash oqsil aralashmasining murakkabligini kamaytirishda ham muhim ahamiyatga ega. 2-DE jeliga yuklanadigan oqsil fraktsiyasi oqsillarning mahalliy zaryadlarini saqlaydigan va eruvchanligini ta'minlaydigan past ionli quvvatli denaturatsiya qiluvchi buferda bo'lishi kerak.

    Ushbu qism IEF tomonidan amalga oshiriladi. Ushbu usuldan foydalanib, oqsillar pI asosida ajratiladi, bunda oqsil aniq zaryadga ega emas va elektr maydonida ko'chib o'tmaydi.

    Konditsioner bosqichi IEF tomonidan ajratilgan oqsillarga ikkinchi o'lchovdan oldin qo'llaniladi. Bu jarayon disulfid aloqalarini kamaytiradi va natijada sistein qoldiqlarining sulfhidril guruhlarini alkillaydi. Bir vaqtning o'zida oqsillar molekulyar og'irligi bo'yicha ajratish uchun SDS bilan qoplangan.

    Ushbu qism SDS-PAGE tomonidan amalga oshiriladi. Jelni tanlash oqsil molekulyar og'irligi diapazoniga bog'liq. Ko'p jelni bir vaqtning o'zida va bir xil sharoitda ishlatish qobiliyati jel-jelni solishtirish uchun muhimdir.

    Jellardagi oqsillarni tasavvur qilish uchun ular qandaydir tarzda bo'yalgan bo'lishi kerak. Bo'yash usulini tanlash bir qancha omillar bilan belgilanadi, shu jumladan kerakli sezuvchanlik, chiziqli diapazon, foydalanish qulayligi, xarajatlar va mavjud tasvir uskunalari turi. Hozirgi vaqtda ideal universal dog 'yo'q. Ba'zida oqsillar quyida batafsil tavsiflangan western blotting orqali membranani qo'llab-quvvatlashga o'tgandan keyin aniqlanadi.

    Ma'lumotni raqamli shaklda to'plash qobiliyati 2-DE jellarini proteom ma'lumotlarini yig'ishning amaliy vositasi bo'lishga imkon beradigan asosiy omillardan biridir. Bu jellarni beg'araz taqqoslash va katta hajmdagi ma'lumotlarni kataloglash imkonini beradi. Ko'p turdagi tasvir qurilmalari proteomika ma'lumotlarini to'plash, talqin qilish va solishtirish uchun maxsus mo'ljallangan dasturiy ta'minot bilan o'zaro bog'lanadi. 2-DE ning eng katta muammolaridan biri oqsillarning murakkab aralashmalarini tahlil qilish va solishtirishdir. Hozirgi vaqtda ikki o'lchovli jel naqshlarini solishtirishga qodir ma'lumotlar bazalari mavjud. Ushbu tizimlar miqdoriy tahlilda zarur bo'lganlarni aniq aniqlash uchun dog'larni avtomatik ravishda taqqoslash imkonini beradi.

    Qiziqarli oqsillar differentsial tahlil yoki boshqa mezonlar bo'yicha tanlanganidan so'ng, ularni spektrometriya yordamida identifikatsiyalash uchun jellardan ajratish, ajratish va hazm qilish mumkin. Bu usul peptid massasi barmoq izlari sifatida tanilgan. Matritsa yordamida lazer desorbsiyasi/ionlanishining uchish-massa spektrometriyasi (MALDI-TOF MS) yordamida molekulyar og'irlikni aniq aniqlash va peptid massasi mosligi uchun ma'lumotlar bazalarini qidirish yuqori oqimli oqsillarni aniqlash imkonini berdi. MALDI-TOF tomonidan aniqlanmagan oqsillarni LC-MS-MS Q-TOF elektr spreyi yordamida ketma-ket belgilash yoki de novo tartiblash orqali aniqlash mumkin.

    3.14 Ikki o'lchovli gel elektroforezi. Proteinlar Chlamydomonas reinhardtii peptid massasi barmoq izlarini tahlil qilish uchun MALDI-MS mos keluvchi kumush reagent bilan bo'yalgan preparativ jellardan 2-DE tomonidan hal qilinadi. Birinchi o'lchov: 3-11 pH gradiyentli izoelektrik fokus. Ikkinchi o'lchov: SDS-PAGE 12% akrilamidli (2,6% o'zaro bog'lovchi) jelda (qalinligi 1,0 mm). Doira bilan belgilangan raqamlangan dog'lar keyinchalik MALDI-TOF MS tomonidan aniqlanadigan oqsillarga mos keladi. Protein ketma-ketligini MALDI-TOF MS tahlili quyida 3.3-bo'limda batafsilroq ko'rib chiqiladi.

    Tepaga qaytish

    Antikorlarning tuzilishi va ishlab chiqarilishi

    An antikor, sifatida ham tanilgan immunoglobulin (Ig), - bu antigen stimulyatsiyasidan keyin plazma hujayralari tomonidan ishlab chiqariladigan oqsil. Antikorlar gumoral immunitetning funktsional asosidir. Antikorlar qonda, oshqozon va shilliq sekretsiyalarda va ona sutida paydo bo'ladi. Bu tana suyuqliklaridagi antitelalar patogenlarni bog'lab, hujayralarga zarar etkazishdan oldin ularni fagotsitlar tomonidan yo'q qilinishi uchun belgilashi mumkin. Antikor bilan bog'langan molekula deyiladi antijen. Antikorlar bitta antijen yoki yuqori darajada saqlanib qolgan strukturaviy xususiyatlarga ega bo'lgan antijenlar guruhi uchun juda o'ziga xosdir. Proteinlar antikorlar tomonidan tan olingan antijenlar vazifasini bajarishi mumkin. Shunday qilib, biokimyo va molekulyar biologiya sohasida antikorlar oqsillarning funktsiyasi va ekspressiyasini aniqlashga yordam beradigan muhim vosita sifatida ishlatiladi. Ular saraton kabi kasalliklarni davolashda ham terapevtik qo'llanilishi mumkin.

    Antikor tuzilishi

    Biokimyoviy metodologiyalarda qo'llaniladigan eng keng tarqalgan antikor turi immunoglobulin G (IgG) sifatida tanilgan va ushbu bo'limning diqqat markazida bo'ladi. IgG antikorlari molekulasi to'rtta polipeptiddan iborat: 3.15-rasmda ko'rsatilganidek, ikkita bir xil og'ir zanjirlar (katta peptid birliklari), ular bir-biriga &ldquoY&rdquo shakllanishida qisman bog'langan bo'lib, ular ikkita bir xil engil zanjirlar (kichik peptid birliklari) bilan qoplangan. . Antikor molekulasidagi sistein aminokislotalari orasidagi bog'lanishlar polipeptidlarni bir-biriga bog'laydi. Antikorda antijen tanilgan joylar o'zgaruvchan domenlardir va antikor bazasi doimiy domenlardan iborat.

    3.15 -rasm Immunoglobulin G (IgG) tuzilishi a) jinsiy hujayrali B hujayrasi pishgan sari DNK rekombinazasi fermenti tasodifiy ravishda engil zanjir genidan V va J segmentlarini chiqaradi. MRNK darajasida birlashish genlarning keyingi tartiblanishiga olib keladi. Natijada, (b) har bir etuk B hujayrasi boshqa antigenni bog'lash qobiliyatiga ega noyob o'zgaruvchan hududga ega bo'lgan yagona antikor ishlab chiqaradi.

    Jinsiy chiziqli B hujayralarida engil zanjir genining o'zgaruvchan hududida 40 o'zgaruvchi (V) va beshta qo'shilish (J) segmentlari mavjud. DNK rekombinazasi deb ataladigan ferment tasodifiy ravishda bu segmentlarning ko'pini B hujayralarining kamolotidan chiqarib yuboradi va bitta V segmentini bitta J segmentiga birlashtiradi. RNKni qayta ishlash jarayonida bitta V va J segmentdan tashqari hamma qismlarga bo'linadi. Rekombinatsiya va biriktirish 10 dan ortiq VJ kombinatsiyalariga olib kelishi mumkin! Natijada, inson tanasidagi har bir differentsiatsiyalangan B hujayrasi odatda o'ziga xos antigenni tan oladigan o'ziga xos o'zgaruvchan zanjirga ega. Antikorlarni bog'lamaydigan doimiy domen barcha antikorlar uchun bir xil.

    Poliklonal antikorlar ishlab chiqarish

    Tadqiqot va diagnostika maqsadida ishlatiladigan antikorlar ko'pincha laboratoriya hayvonlariga, masalan, quyon yoki echkiga ma'lum bir in'ektsiya yo'li bilan olinadi. antigen. Bir necha hafta ichida hayvonning immunitet tizimi antigenga xos bo'lgan yuqori darajadagi antikorlarni ishlab chiqaradi. Bu antitelalarni birida yig'ish mumkin antiserum, bu antijen ta'siridan keyin hayvondan to'plangan butun sarum. Aksariyat antijenler bir nechta epitopli murakkab tuzilmalar bo'lganligi sababli, ular laboratoriya hayvonlarida bir nechta antikorlarni ishlab chiqarishga olib keladi. Bu shunday deb ataladi poliklonal antikor javob, shuningdek, inson immunitet tizimining infektsiyaga javobiga xosdir. Hayvondan olingan antiserum shunday qilib, B hujayralarining bir nechta klonlaridan antikorlarni o'z ichiga oladi, har bir B hujayrasi antigendagi o'ziga xos epitopga javob beradi (3.16-rasm).

    3.16 -rasm. Poliklonal antikor ishlab chiqarish. Ushbu diagrammada antigenga javoban ishlab chiqarilgan poliklonal antikorlarni yig'ish jarayoni ko'rsatilgan.

    Antiserum ishlab chiqarishda laboratoriya hayvonlariga odatda kamida ikki marta antijen yuboriladi. Ikkinchi in'ektsiya sinfni yaratadigan xotira hujayralarini faollashtiradi IgG antijenga qarshi antikorlar. Xotira hujayralari ham o'tadi yaqinlik kamoloti, natijada o'rtacha yaqinligi yuqori bo'lgan antikorlar havzasi paydo bo'ladi. Afinitning kamoloti immunoglobulin genining o'zgaruvchan hududlaridagi mutatsiyalar tufayli yuzaga keladi, natijada antijen bilan bog'lanish joylari biroz o'zgargan B hujayralari paydo bo'ladi. Antigenga qayta ta'sir qilganda, yuqori yaqinlikdagi antigen bilan bog'lanish joylariga ega bo'lgan antikor ishlab chiqarishga qodir bo'lgan B hujayralari o'zlarining past yaqinlikdagi tengdoshlariga qaraganda ko'proq antikor ishlab chiqarishga rag'batlantiriladi. An yordamchi, ko'proq antikor ishlab chiqarishni rag'batlantiradigan immunitet tizimining umumiy faollashuvini qo'zg'atadigan kimyoviy moddadir, ko'pincha in'ektsiyadan oldin antijen bilan aralashtiriladi.

    Hayvonlardan olingan antiserum tarkibida nafaqat laboratoriyada sun'iy ravishda kiritilgan antijenga qarshi antikorlar, balki u hayot davomida ta'sir qilgan boshqa antijenlarga ham antikorlar bo'ladi. Shu sababli, antikorlarni tadqiqot yoki diagnostik tahlil uchun ishlatishdan oldin, boshqa antitelalarni olib tashlash uchun antiserani birinchi navbatda & ldquopurified & rdquo bilan tozalash kerak.

    Monoklonal antikorlarni ishlab chiqarish

    Ba'zi tahlil turlari poliklonal antiserum yordamida olinganidan ko'ra yaxshiroq antikor o'ziga xosligi va yaqinligini talab qiladi. Bu o'ziga xoslikka erishish uchun barcha antikorlar bitta epitopga yuqori yaqinlik bilan bog'lanishi kerak. Bu yuqori o'ziga xoslik bilan ta'minlanishi mumkin monoklonal antikorlar (mAbs). 3.4 -jadvalda monoklonal va poliklonal antikorlarning ba'zi muhim xususiyatlari solishtiriladi.

    3.4 -jadval. Monoklonal va poliklonal antikorlarni solishtirish

    Tirik hayvonlarda ishlab chiqariladigan poliklonal antikorlardan farqli o'laroq, monoklonal antikorlar ishlab chiqariladi in vitro to'qimalarni etishtirish texnikasidan foydalanish. mAblar hayvonni, ko'pincha sichqonchani ma'lum bir antijen bilan bir necha marta immunizatsiya qilish orqali ishlab chiqariladi. Keyin immunizatsiya qilingan hayvonning taloqidan B hujayralari chiqariladi. Oddiy B hujayralari abadiy ko'paya olmasligi sababli, ular hosil bo'lish uchun miyelom hujayralari deb ataladigan o'lmas, saraton B hujayralari bilan birlashadi. gibridoma hujayralar. Keyin barcha hujayralar selektiv muhitga joylashtiriladi, bu faqat gibridomalarning o'smagan myeloma hujayralari o'sishiga imkon bermaydi va B hujayralari o'lmaydi. Antikor ishlab chiqarishda madaniyatda uzluksiz o'sishga qodir gibridomalar keyinchalik kerakli mAb uchun tekshiriladi. Kerakli mAb hosil qiladiganlar to'qima madaniyatida o'stiriladi, madaniy muhit vaqti-vaqti bilan yig'iladi va mAblar muhitdan tozalanadi. Bu juda qimmat va ko'p vaqt talab qiladigan jarayon. Tajriba yoki bitta bemorni davolash uchun etarli mAb miqdorini ta'minlash uchun bir necha haftalik madaniyat va ko'p litrli muhit kerak bo'lishi mumkin. mAblar qimmat (3.17 -rasm).

    3.17 -rasm. Monoklonal antikorlar (mAbs) Ular sichqonga antigen kiritib, keyin poliklonal B hujayralarini sichqon va taloqdan miyeloma hujayralariga birlashtirish orqali hosil bo'ladi. Olingan gibridoma hujayralari ekiladi va antigenga antikor ishlab chiqarishni davom ettiradi. Kerakli mAb hosil qiluvchi gibridomalar keyinchalik kerakli mAb ni olish uchun vaqti-vaqti bilan yig'ib olinadigan selektiv muhitda ko'p miqdorda o'stiriladi.

    Tepaga qaytish

    Ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) va mikroarraylar

    Antijenlarni aniqlash uchun antikorlardan birinchi foydalanishdan boshlab, antikorlarning boshqa molekulalar bilan bog'lanish qobiliyatidan foydalanadigan ko'plab turli xil texnologiyalar ishlab chiqildi. 1950 -yillar davomida olimlar Yalov va Berson radioaktivlik yordamida eritmadagi analit miqdorini aniqlash usulini ishlab chiqdilar. Yarlou 1977 yilda Nobel mukofotiga sazovor bo'lgan bu "radioimmunoassay" (RIA) gormonlarni aniqlash uchun juda sezgir usul edi, ammo antigenlarni aniqlash uchun radioaktivlikdan foydalanish xavfsiz emas va umumiy foydalanish uchun mos emas. Shunday qilib, radioaktiv molekula o'rniga fermentlarni antikorlar bilan bog'lash va molekulalarni sirtlarga yopishtirish orqali muqobil protsedura ishlab chiqilgan. Bugungi kunda eng keng tarqalgan ilovalardan biri namunadagi biomolekula miqdorini "enzim bog'langan immunosorbent assay" (ELISA) yordamida o'lchashdir. Bu atama dastlab antikor va uning bog'lovchi sherigi o'rtasidagi o'zaro ta'sir haqida xabar berish uchun fermentdan foydalanishni anglatadi (Gan & Patel, 2013). Shvetsiyadagi Perlmann va Engvall (Engvall & amp Perlmann, 1971), shuningdek, immobilizatsiyalangan va ferment bilan o'zgartirilgan erta reagentlar bilan tahlillarni yaratgan Gollandiyalik Schuurs va van Weemen (Van Weemen & Schuurs, 1971) uchun asos. Bugungi kunda olimlar antikor-antijen o'zaro ta'sirini tasavvur qilish uchun qo'zg'alganda yorug'lik chiqaradigan rangli molekulalardan (ftoroforlar deb ham ataladi) foydalanadilar. Eksperimental protseduralarning ko'plab variantlari ishlab chiqilgan va qiziqish nishonini aniqlash uchun bir nechta antikorlardan foydalangan holda tahlillar qurish odatiy holdir (3.xx C-D rasmga qarang). Immunoassay formati taqdim etayotgan imkoniyatlarni yanada oshirish uchun mikroarraylarga asoslangan ilovalar ishlab chiqildi va ular bitta reaksiya kamerasida bir nechta molekulalarni o'lchash imkonini beradi (pastga qarang).

    ELISA tahlili dizayni

    Antikorlardan foydalanish mo'ljallangan tahlil uchun tajribalarni har xil usulda loyihalashtirishga imkon beradi. Tajribadan mumkin bo'lgan eng yaxshi natijalarga erishish uchun turli reagentlar, qo'shimchalar va eritmalar ularning optimal kombinatsiyasi va konsentratsiyasi, inkubatsiya vaqtlari va yuvish davrlari sonini baholash va sozlash uchun sinovdan o'tkazilishi kerak. Bu tahlilni qiziqtirgan maqsadni aniqlashga xalaqit beradigan kiruvchi shovqinlardan qochishdir. Bundan tashqari, 3.18-rasmda tasvirlanganidek, nishonni aniqlash va aniqlash usuli bir necha usullar bilan amalga oshirilishi mumkin.

    3.18 -rasm. ELISA va boshqa immunomodullar uchun turli xil sozlamalar. ELISA tahlilida antikorlar (A) immobilizatsiya qilingan antijeni aniqlay oladi, (B) etiketli antijeni ushlaydi, (C) etiketlanmagan antijeni ushlaydi va qo'lga olingan antijeni aniqlash uchun ikkinchi, etiketli antikorni ishlatadi yoki (D) uchdan birini ishlatadi. aniqlash uchun antikor yoki hatto aniqlash uchun ikkita antikordan foydalaning (E). Antikor yoki antijenni (A), (B) va (C) dagi kabi to'g'ridan -to'g'ri markalash - aniqlashning eng oddiy va tezkor usuli. (D) va (E) da ko'rsatilgandek, aniqlash usuli sifatida ikkilamchi antikorlardan foydalanish tahlilning sezuvchanligi va selektivligini yanada oshiradi. (D) da qo'llaniladigan usul ham ko'proq moslashuvchanlikni ta'minlaydi, holbuki (E) usuli o'ziga xoslikni yanada oshiradi, chunki reportyor molekula hosil qilish uchun uchta antikor antigenni bog'lashi kerak. Taqdim etilgan tahlillardan eng ko'p ishlatiladigan tushunchalar (C) va (D) da ko'rsatilgan.

    Multiplekslash

    Immunoassaylarning yangi davri mikroarraylar deb nomlangan texnologiyaning rivojlanishi bilan boshlandi. Mikroarray atamasi odatda kichik sirt ustida qurigan kichik tomchilarning tartibli tashkil etilishini tavsiflaydi. Reaktsiya o'lchamlari kichiklashtirilgan bo'lib, ko'plab tahlillar bir nechta namunalarda parallel ravishda amalga oshirilishi mumkin, atrofdagi eritmaga bir necha minglab turli xil xususiyatlar taqdim etilishi mumkin. Bu shuni anglatadiki, olimlar bitta tajriba yordamida ko'p sonli molekulalarni o'lchashlari mumkin. Mikroskopli shisha slaydlar va shisha yuzasiga juda kichik tomchilar (1 nl = 0.000000001 litr) joylashtirilgan maxsus robototexnika vositalaridan foydalanish imkoniyati mavjud. Bu bir millimetrdan kam diametrli (0,15 mm) dog'larni qoldiradi. Multiplekslashning yana bir keng tarqalgan usuli - undan ham kichikroq va rangli kodlangan zarrachalardan foydalanish (diametri 0,005 mm). Bu zarralar analitni eritmadan chiqarib olish uchun antikorlar bilan qoplangan bo'lishi mumkin.

    Sezuvchanlik

    Ko'pgina ilovalarda ma'lum bir namunadagi molekulaning juda kichik miqdorlarini (ba'zan faqat izlarini) o'lchash muhim ahamiyatga ega. Kerakli sezuvchanlikka erishish uchun tajriba shartlarini antikorlarga, aniqlash tizimiga va namunalar turiga moslashtirish kerak. Bundan tashqari, yaxshiroq ranglar, signal kuchaytiruvchi maxsus lazer va filtrlardan foydalanish, shuningdek miniatyuralash bo'yicha yutuqlarga erishilmoqda (Ekins & amp Edvards, 1997).

    Maxsus misollar

    Elishay tahlillari asosiy tadqiqotlar va klinik diagnostikada qanday qo'llanilishi haqida ko'plab misollar mavjud. Aniq misollardan biri prostata saratonini aniqlash uchun ishlatiladigan biomarker bo'lgan protein prostata xos antijeni (PSA) miqdorini aniqlash uchun ishlatiladigan sezgir sendvich tipidagi ferment bilan bog'liq immunoassay (Kuriyama va boshq., 1980).

    Boshqa tomondan, mikroarray tahlillari ilgari DNK va RNK molekulalarini parallel tahlil qilishda katta e'tiborga sazovor bo'lgan. Antikorli oqsillarni tahlil qilish uchun ularning afzalliklarini tahlil qilish uchun yangi protokollar va tartiblarni ishlab chiqish va o'rnatish kerak edi. Hozirgi vaqtda turli xil namuna turlarida (masalan, hujayralar, qon zardobi, siydik) oqsillar miqdorini o'lchash, oqsillarning biologik jarayonlarda qanday o'zgarishini aniqlash uchun (masalan, fosforillanish) yoki o'ziga xos oqsil-oqsil o'zaro ta'sirini tasvirlashning ko'p tomonlama usullari mavjud. Yana bir misol - bemorlarning qonida aylanib yuradigan antikorlarni tahlil qilish. Mikroarray asosidagi ilovalar, shuningdek, tozalangan antikorlar uchun va antikorlarni bog'lash xususiyatlarini o'rganish uchun yaratilgan va bog'lovchi reagentlarni tadqiqot reagentlari sifatida ishlatishda muhim jihatdir. Bunday proteinli mikroto'lqinlar bog'lovchi reagentning o'ziga xosligini tekshirish uchun oqsillardan, oqsil bo'laklaridan yoki kichik peptidlardan iborat bo'lishi mumkin. Protein mikromassivlari butun oqsillar yoki kattaroq oqsil bo'laklari bilan o'zaro ta'sirni ko'rsatishi mumkin, peptid mikroarraylari esa antikorlar oqsillarning qaysi alohida qismlari (epitoplar) bilan bog'lanishini ko'rsatadi. Odatda epitop xaritalash natijasi 3.19 -rasmda ko'rsatilgan (Edfors va boshq., 2014). Millionlab bir -biriga o'xshash peptidlarni bunday massivlarda bitta amino kislotalar qoldig'i siljishi bilan sintez qilish, antikorlarni bog'laydigan hududlarni yuqori aniqlikda xaritalash imkonini beradi. Bu antikor tomonidan tan olingan chiziqli (uzluksiz) epitoplar haqida juda batafsil ma'lumot beradi. Xuddi oqsillar, oqsil bo'laklari yoki boshqa antijenlar singari, peptidlarni massivlarga yig'ish ham yuqumli va otoimmun kasalliklari bo'lgan bemorlarning plazma namunalarida antikorlarning reaktivligini o'rganish uchun ishlatilishi mumkin.

    3.19-rasm. Poliklonal antikorlarning epitop xaritasi. Peptidlar qatoriga bog'langan poliklonal antikorlar, natijada to'rtta aniq chiziqli epitoplar va bir-biriga bog'langan ketma-ket bir-biriga yopishgan peptidlar ko'rsatiladi. X o'qi: peptidlar, Y o'qi: o'rtacha floresans intensivligi (MFI). (Edfors va boshq., 2014)

    Tepaga qaytish

    Western Blot

    Western Blot (WB) - oqsillarni aniqlash va tahlil qilishning keng tarqalgan usuli.U elektroforez bilan ajratilgan oqsillarni jeldan membranaga o'tkazishni o'z ichiga olgan texnikaga asoslanadi, ya'ni blot deb ham ataladi. Jarayon birinchi marta 1979 yilda H. Towbin va boshqalar tomonidan tasvirlangan (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) va ikki yildan so'ng uning nomini W. Neal Burnette (Bernette, 1981) bergan. Towbin va boshqalar oqsillarni poliakrilamid jellardan nitroselüloz varaqlariga elektroforetik o'tkazishni tasvirlab berdilar, bu erda asl jel naqshlari aniq olingan. O'rnatish etti bosqichdan iborat standart to'plamdan iborat, 3.20 -rasm.

    3.20 -rasm. Western blotingda standart qadamlar. Standart bosqichlar namunani tayyorlash (1), gel elektroforezi (2), membranani tozalash (3), antikorlarni tekshirish (4), aniqlash (5), tasvirlash (6) va tahlilni (7) o'z ichiga oladi.

    Namunalar tayyorlanadi va jelga yuklanadi va elektroforez paytida manfiy zaryadlangan oqsillar musbat zaryadlangan anod tomon siljiydi. Proteinlarni qo'shimcha tahlil qilish uchun ular blotting deb ataladigan usulda membranaga o'tkaziladi. O'tkazilgandan so'ng, membrana va oqsillarning kiruvchi ta'sirini oldini olish uchun membrana bloklanadi. Qiziqarli oqsilni tasavvur qilish uchun membranani birinchi navbatda oqsilga xos bo'lgan birlamchi antikor yordamida, so'ngra aniqlash uchun ishlatiladigan ikkilamchi antikor yordamida tekshiriladi. Membrananing tasviri olinadi va natija tahlil qilinadi.

    Jel ichidagi quduqlardan biriga alohida marker eritmasini qo'shib, o'ziga xos oqsilni tekshirish uchun ishlatiladigan antikorlarning o'zaro ta'siridan tashqari, oqsil hajmini ham taxmin qilish mumkin. Jelni ajratish nafaqat hajmiga bog'liq, balki ma'lum darajada molekulyar zaryadga, hidrofob hududlarga va denaturatsiya darajasiga bog'liq. Eksperimentni o'rnatish muayyan so'rovga eng mos keladigan tarzda ko'p jihatdan o'zgarishi mumkin. Natijalarni tahlil qilishda, yuklash bo'yicha chiziqlar orasidagi farqlar va blotlar orasidagi uzatish tezligini hisobga olish kerak. Bundan tashqari, namunalarning kontsentratsiyasi oralig'ida hosil bo'ladigan signalning chiziqli bo'lmagan aloqasi ham natijalarni talqin qilishda e'tiborga olinadigan jihatdir. JB eksperimentining natijasi uchta muhim omilga bog'liq: antikorning o'ziga xos oqsilni bog'lash qobiliyati, o'zaro ta'sir kuchi va o'zi qiziqqan oqsilning kontsentratsiyasi. Bundan tashqari, nishonga bog'lanishning o'ziga xosligi va past reaktivlik ham muhim xususiyatlardir. JB natijasini har doim ham izohlash oson emas, chunki oqsilning o'lchami glikosillanish yoki boshqa oqsillar bilan o'zaro ta'sir kabi posttranslyatsion modifikatsiyalar tufayli nazariy vazndan farq qilishi mumkin. Ammo, JB juda keng tarqalgan usul va deyarli barcha mavjud tijorat antikorlari bu usul yordamida tasdiqlangan.

    Namuna tayyorlash

    JBning birinchi bosqichi namunani tayyorlashdir, masalan. tahlil qilinadigan to'qima, hujayralar yoki boshqa eritma. Odatda to'qimalarni aralashtirish, homogenlash yoki sonikatsiya bilan parchalash kerak. Hujayralarni ajratish va oqsillarni eritish uchun buferlar qo'shiladi va ko'pincha denaturatsiya yoki degradatsiyani oldini olish uchun ingibitor qo'shiladi. Namunalarni keyingi tayyorlash uchun har xil turdagi filtrlash va santrifüjlash usullari qo'llaniladi. Namunalarni taqqoslash uchun jelga ma'lum miqdorni yuklash uchun hosil bo'lgan ekstraktning umumiy oqsil konsentratsiyasini aniqlash muhim. Odatda protein kontsentratsiyasini aniqlash uchun biokimyoviy tahlil qo'llaniladi. Keyin ekstrakt glitserin va bo'yoqdan (masalan, bromofenol ko'k) iborat yuklash buferi bilan suyultiriladi. Glitserin ekstraktning zichligini oshirish orqali yuklashni soddalashtirish uchun ishlatiladi va namunani ko'rish uchun bo'yoq qo'shiladi. Protein tuzilmalarini buzish uchun namunalarga issiqlik surtiladi, bu esa manfiy zaryadni zararsizlantirishdan saqlaydi (Mahmood & amp Yang, 2012). Proteinning identifikatsiyasini, shuningdek, antikorning faolligini tasdiqlash uchun, ijobiy va salbiy nazoratlar o'rnatiladi.

    Jel elektroforez

    Namuna tayyorlashdan so'ng, ekstrakt jel elektroforezi orqali oqsillarni o'lchamiga qarab ajratish uchun yuklashga tayyor. Jel ustida zaryadlangan molekulalarning harakatlanishiga olib keladigan elektr maydoni qo'llaniladi. WBda poliakrilamid jellari oqsillarni ajratish uchun ishlatiladi va shuning uchun mahalliy sharoitdan foydalanganda usul poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) deb ataladi. Denaturatsiya shartlari uchun tizimga natriy dodesil sulfat (SDS) qo'shiladi va shuning uchun bu usul SDS-PAGE deb nomlanadi. SDS oqsil bilan bog'lanadi va o'ziga xos zaryaddan qat'i nazar, oqsil atrofida manfiy zaryadlangan mitsel hosil qiladi. Denaturatsiya holati oqsillarning uch o'lchovli tuzilishini eritib yuboradi va oqsil zaryadi uning hajmiga nisbatan bo'ladi, natijada oqsillar faqat kattaligiga bo'linadi. Tabiiy sharoitlardan foydalanilganda, harakatchanlik zaryadga ham, gidrodinamik hajmga ham bog'liq bo'lib, kimyoviy buzilish, zaryadlanish yoki ochilish, birikish yoki boshqa majburiy hodisalar tufayli konformatsion o'zgarish tufayli zaryadning o'zgarishini aniqlash imkonini beradi.

    Jel odatda har xil zichlikdagi ikki qismdan iborat: (i) biriktiruvchi jel va (ii) ajratuvchi jel, (3.21 -rasm). Ikki bo'lim orasidagi farq pH va jel konsentratsiyasida. Bir oz kislotali pH va akrilamidning past konsentratsiyasi bilan stacking gel oqsillarni yomon ajratadi, lekin ular ajratuvchi jelga kirishdan oldin ularga yuqori aniqlangan o'tkir chiziqlar hosil qilish imkonini beradi. Asosiy shartlar va jel konsentratsiyasi yuqori bo'lganda, ajratuvchi jel oqsillarni kattaligiga ko'ra farq qiladi, chunki kichik oqsillar jelga qaraganda kattaroqlarga qaraganda tezroq ketadi. Prekast jellari qulay, ammo ularni qo'lda quyish mumkin. Jel buferga botiriladi va oqsil namunalari va markerlari jeldagi quduqlarga yuklanadi. Jelga kuchlanish qo'llaniladi va oqsillar salbiy elektr zaryadi tufayli jel bo'ylab harakatlana boshlaydi. To'g'ri kuchlanishni tanlash juda muhim, chunki juda yuqori kuchlanish jelni haddan tashqari qizib ketadi va bantlarni deformatsiyalashi mumkin.

    3.21 -rasm. Buferdagi odatiy vertikal poliakrilamid jeli

    Membranaga parchalanish

    Jel elektroforezidan so'ng oqsillar qattiq qo'llab-quvvatlovchi membranaga o'tkaziladi, bu Western Blotning uchinchi bosqichidir. O'tkazish jarayonida oqsillarni jeldan membranaga o'tkazish uchun kuchlanish qo'llaniladi. O'rnatish shimgichni, filtr qog'ozlarini, jelni va jel va musbat elektrod orasiga qo'yilgan membranani o'z ichiga oladi (3.22-rasm). Bu manfiy zaryadli oqsillarning jeldan membranaga ko'chishini ta'minlaydi. Membranalarning uch turi mavjud: nitroselüloz, poliviniliden diflorid (PVDF) va neylon. Neylon membranalar bir necha jihatlardan ustun bo'lsa -da, ba'zi bir bo'yoqlarning orqa fonda biriktirilishi va qaytarilmas binoni bu membranani boshqa ikkita alternativaga qaraganda kamroq uchraydi. Nitrotsellyuloza membranalarining asosiy afzalligi aniqlash usulidan qat'i nazar, past fon hisoblanadi. Nisbatan katta gözenek kattaligi tufayli past molekulyar og'irlikdagi oqsillarni o'tkazish uchun nitroselüloz membranalardan foydalanilmasligi kerak. Bundan tashqari, quriganida membrana mo'rt bo'lib qoladi, bu esa ularni boshqarishni qiyinlashtiradi. Yana barqaror PVDF membranasi qayta markalash imkonini beradi va saqlash uchun qulayroqdir. PVDF ning hidrofobik tabiati oqsillarni bog'lash qobiliyatining yuqori bo'lishiga olib keladi, ammo buning natijasida fon ham yuqori bo'ladi.

    3.22 -rasm. Western Blotingni o'tkazish tartibi. Jildagi oqsillar membranaga o'tkaziladi va namuna blokirovka qilish, antikorlarni qo'shish va ma'lum bir jadvalga muvofiq yuvish orqali tasvirlanadi.

    Tozalashning nam va yarim quruq deb ataladigan ikkita usuli bor. Nam sharoitlar, agar uzatish samarali bo'lishi va aniq va aniq tasmalarga nisbatan yuqori sifatni berishi zarur bo'lsa. Bundan tashqari, bu katta protein kompleksini o'tkazish uchun eng yaxshi tanlovdir. Jel, membrana va filtr qog'ozlari uzatish vaqtida buferga to'liq botiriladi va jelni quritish xavfi yo'q. Yarim quruq tozalash tezroq bo'ladi va buferga kamroq hajm kerak bo'ladi. Biroq, bu o'tkazish usuli odatda kamroq samaralidir, ayniqsa kattaroq oqsillar uchun va uzaytirilgan uzatish vaqtlaridan foydalanganda jelni haddan tashqari qizib ketish va quritish xavfi mavjud.

    Antikorlarni tekshirish

    JBning to'rtinchi bosqichi - antikorlarni tekshirish. Antikorlarning membranaga xos bo'lmagan birikishini oldini olish uchun, qiziqish oqsiliga xos bo'lgan bog'lanish o'rniga, membranadagi qoldiq joylarni blokirovka qilish uchun modda ishlatiladi. Umumiy ishlatiladigan moddalar-quritilgan yog'siz sut, 5% sigir sarum albumin (BSA), Tris buferli tuzli eritmasi (TBST) bilan suyultiriladi, oddiy echki zardobi, kazein yoki baliq jelatinidir (Mahmood & amp Yang, 2012). Sutni ushlab turish oson va arzon, ammo barcha belgilarga mos kelmaydi. Baliq jelatini pastroq fon beradi, lekin ba'zi oqsillarni maskalashi mumkin, shuningdek, nisbatan qimmat blokirovka qiluvchi bufer bo'lishi mumkin. BSA arzon, zardobda o'zaro reaktivlikni keltirib chiqaradigan immunoglobulinlar bo'lishi mumkin. Bloklovchi vositani ehtiyotkorlik bilan tanlash muhim, chunki blokirovka qiluvchi buferlarning hech biri barcha turli xil antigen-antikor o'zaro ta'sirlari uchun ideal emas. Bloklash jarayoni membranani tegishli blokirovka buferida bir soat yoki undan ko'proq vaqt davomida inkubatsiya qilishdan iborat. Uzoq inkubatsiya vaqtidan foydalanganda, artefaktlar yoki fonga dog 'tushish xavfini istisno qilish uchun blokirovkalash +4 ° C da bajarilishi kerak. Bloklash - bu qiziqish oqsilidan signalni kamaytirmasdan fonni kamaytirish o'rtasidagi nozik muvozanat.

    Bloklangan membrana keyin birlamchi antikor bilan inkubatsiya qilinadi. Antikor TBST, fosfat buferli tuzli eritma (PBS) yoki yuvish buferida mos konsentratsiyaga qadar suyultiriladi. Agar antikor qayta ishlatilsa, antikorni BSA bilan inkubatsiya qilish afzaldir. Membranani yuvgandan so'ng, membrana birlamchi antikor bilan bog'laydigan ikkilamchi antikor bilan inkübe qilinadi. Ikkilamchi antikor muxbir bilan belgilanadi. Ikkilamchi antikor sifatida poliklonal antikordan foydalanilganda, u qandaydir fonni keltirib chiqarishi mumkin. Fon bo'yalgan taqdirda, ikkilamchi antikor u hosil bo'lgan xostning immun bo'lmagan zardobi bilan oldindan bloklanishi mumkin. Antikorlar va aniqlash tizimi o'rtasidagi ancha keng tarqalgan o'zgarishlar tufayli ikkilamchi antikor kontsentratsiyasini optimallashtirish tavsiya etiladi. ishlatilgan.

    Aniqlash

    JBning beshinchi bosqichida membranada oqsil-antikor-antikor kompleksi aniqlanadi. Ikkilamchi antikorni markalashning bir necha turlari mavjud, masalan. fermentlar, ftoroforlar, biotinillanish, oltin konjugatsiyasi va radioizotoplar, 3.23-rasmda ko'rsatilgan. Fermentlar orasida eng keng tarqalgani HRP kimyoluminesans, kimyofloresan yoki xromogen moddalar bilan birgalikda ishlatiladi. HRP past fonni beruvchi yuqori substrat o'ziga xosligiga ega, barqaror va arzon. Chemiluminesensense HRP fermenti luminol peroksidni aniqlash reaktividan luminol oksidlanishini katalizlaydi. Ko'p bosqichli reaktsiya yorug'lik chiqarishni keltirib chiqaradi. Fenol kabi ba'zi kimyoviy moddalar chiqadigan nurni kuchaytirishi mumkin. To'g'ridan-to'g'ri usul - flüoresansdan foydalanish, ftoroforlar hayajonlangandan keyin yorug'lik chiqaradi va hech qanday aniqlash agenti kerak emas. Bu miqdoriy G'arb uchun juda mos keladi va turli floroforlar turli to'lqin uzunliklarida yorug'lik chiqaradiganligi sababli, bir vaqtning o'zida bir nechta oqsillarni multiplekslash va maxsus aniqlashni amalga oshirish mumkin. Kimyoviy va/yoki fermentdan foydalanib, florogen substratdan faol ftorofor hosil bo'lishini chaqirish kimyofloresans deyiladi. Signal intensivligini yanada oshirish uchun biotin streptavidinga asoslangan ikki bosqichli tizimdan foydalanish mumkin. Oltin konjugatsiyasi, shuningdek, oqsillar oltin to'planishi tufayli to'q qizil rangga bo'yalgan usuldir. Radioizotoplardan ham foydalanish mumkin, lekin ular maxsus ishlov berishni talab qiladi va ancha qimmat.

    3.23 -rasm. Turli reportyor tizimlari.

    Tasvirlash

    Tasvirlash - bu JBning oltinchi bosqichi, uni suratga olish plyonka yordamida analog bo'lishi mumkin yoki har xil turdagi signallarni yozib oluvchi CCD kamerasi yoki skaneri yordamida raqamli tarzda tayyorlanishi mumkin. CCD tasvirlash qurilmasi yuqori aniqlik sezuvchanligi va kimyoviy chiqindisiz yoki qorong'i xonaga ehtiyoj sezmaydigan keng chiziqli diapazonni aniqlash imkonini beradi. U membranalarni, bo'yalgan jellarni aniqlash yoki ultrabinafsha nurlarni qo'llash uchun ishlatilishi mumkin.

    Tahlil

    JBning oxirgi bosqichi - natijalarni tahlil qilish. Odatda, sifatli dasturda qiziqish oqsilining mavjudligi tasdiqlanadi, miqdori vizual tekshirish orqali taxmin qilinadi va o'lcham marker bilan solishtirish orqali aniqlanadi. Yaxshilanishlar va ishlanmalar, ayniqsa yuqori sezgir aniqlash reagentlari va ilg'or tasvirlash usullari bo'yicha WB miqdoriy tahlil uchun potentsial vositaga aylantiradi. Miqdoriy ilovalar oqsil miqdorini nisbiy yoki mutlaq ma'noda aniqlashni talab qiladi. Sezuvchanlik, signal barqarorligi, chiziqli dinamik diapazon, normalizatsiya va signal-shovqin nisbati kabi ba'zi omillarni hisobga olish kerak. Berilgan tahlilda ko'rish mumkin bo'lgan minimal protein aniqlash chegaralarini (LOD) beradi va aniq miqdorni aniqlash uchun ishonchli ishlatilishi mumkin bo'lgan signal intensivligi chegarasi - bu miqdor chegarasi (LOQ). Bu atamalarga ta'sir etuvchi omillar - antikorlarning sifati va konsentratsiyasi, shuningdek, aniqlangan oqsilning minimal miqdorini hisobga olganda ta'sir qilish vaqti. Barqaror signal tizimi yuqori sezuvchanlik, bir necha marotaba ta'sir qilish va zaif diapazonlarni aniqlash imkoniyatiga erishish uchun vaqt oynasini kengaytiradi. Signalning intensivligi oqsil miqdoriga mutanosib bo'lgan tekis va aniq miqdorni aniqlashga imkon beradigan diapazon chiziqli dinamik diapazon deb ataladi. Haddan tashqari oqsil miqdori yoki antikorlarning yuqori konsentratsiyasi tufayli signalning to'yinganligini oldini olish muhim. Kam LOD va kuchsiz va kuchli signallarning miqdori keng chiziqli dinamik diapazonni beradi. Har bir quduqqa yuklangan oqsil miqdorining o'zgarishiga yoki har xil konsentratsiyaga imkon beradigan ichki ma'lumotni qiziqtiradigan oqsil normallashtirilishi kerak. Bunga uy xo'jaligi yoki spiked protein bilan erishish mumkin. Protein miqdorini to'g'ri aniqlash uchun signal va shovqin o'rtasidagi nisbat muhim ahamiyatga ega. Bu yuqori fon kutilayotgan zaif guruhlarni aniqlashda juda muhim ahamiyatga ega. Odatda Western Blot 3.24-rasmda ko'rsatilgan.

    3.24 -rasm. HRP-konjuge antikorlari va CCD kamerasi yordamida odatiy Western Blot natijasi.

    Tepaga qaytish

    Immunogistokimyo

    Immunohistokimyo (IHC)-bu hujayra tarkibiy qismlarini, masalan, to'qima namunalaridagi oqsillarni yoki boshqa makromolekulalarni vizualizatsiya qilishning kuchli mikroskopiy usuli. IHCning kuchi-bu turli xil hujayralar, biologik holatlar va/yoki murakkab to'qimalar ichidagi hujayralararo lokalizatsiya sharoitida maqsadli oqsilning mavjudligi va lokalizatsiyasini ko'rsatadigan intuitiv vizual chiqish.

    IHC texnikasi 1940-yillarda ixtiro qilingan (Coons, Creech, & Jones, 1941) va muntazam ravishda sog'liqni saqlash va patologiyada muhim vosita sifatida ishlatiladi, masalan. diagnostika maqsadlari yoki bemorlarni optimallashtirilgan davolash rejimlari uchun tabaqalashtirish. IHC, shuningdek, molekulyar, uyali yoki to'qima darajasida sog'lom va kasal hujayralar va to'qimalarda ularning rolini o'rganish uchun qiziqish molekulalari tahlil qilinadigan tadqiqotlarda keng qo'llaniladi. IHC yoki IHCga asoslangan usullar yordamida to'qimalarda nishonlarni vizualizatsiya qilishning turli xil usullari mavjud va turli ilovalar va tahlillar uchun ko'plab protokollar mavjud. IHC odatda mustahkam va aniq usul bo'lsa-da, yangi tahlillar ko'pincha to'qimalarga yoki maqsadli oqsil, bog'lovchi-molekula va/yoki xabarchi tizimining xususiyatlariga qarab ehtiyotkorlik bilan optimallashtirishga muhtoj. Ko'p yillik texnik rivojlanish va o'ziga xos bog'lovchi molekulalarning mavjudligi sezilarli darajada oshishi IHC uchun foydalilik va qo'llash sohalarini sezilarli darajada yaxshiladi. IHCga asoslangan texnika va reaktivlar sohasidagi yutuqlar olimlar va sog'liqni saqlash xodimlariga aniqroq asboblar, tahlillar va biomarkerlardan foydalanish imkonini berdi. Bundan tashqari, texnik yutuqlar, masalan. bir xil namunadagi bir nechta oqsillarni bir vaqtning o'zida yuqori sezgirlik bilan aniqlash va oqsil-oqsil o'zaro ta'sirini aniqlash.

    Klassik IHC tahlili 3.25-rasmda tasvirlangan va yuqori o'ziga xoslikka ega bo'lgan epitoplarni bog'lashga qodir bo'lgan "boshlang'ich antikor" yordamida to'qima namunasida bitta protein-maqsad bilan ifodalangan epitoplarni aniqlashni o'z ichiga oladi. Epitop-antikor bog'lanish hodisasidan so'ng, birlamchi antikorni yuqori o'ziga xoslik bilan bog'lashga qodir "ikkilamchi antikor" qo'shiladi. Ikkilamchi antikor muxbir molekulasi bilan bog'lanadi va antikor-antikor bog'lanish hodisasidan so'ng, kimyoviy substrat qo'shiladi, bu esa reportyor molekulasi bilan reaksiyaga kirishib, butun epitop-antikor kompleksi joylashgan joyda rangli cho'kma hosil qiladi.

    3.25-rasm. Immunogistokimyoning asosiy printsipi. Sxematik rasmda, ma'lum bir oqsil maqsadiga yo'naltirilgan birlamchi antikor yordamida formalin bilan biriktirilgan kerosinli to'qima qismi bo'yalgan. To'qimalar bo'limiga birlamchi antikorni o'z ichiga olgan eritma qo'shiladi va antikorlarga o'z nishonini topib bog'lanishiga biroz vaqt beriladi. Ushbu bosqichdan so'ng, bog'lanmagan va ortiqcha antikorlar yuviladi va ikkilamchi antikor qo'shiladi. Horseradish peroksidaza (HRP) fermentlari bilan bog'lovchi molekula olib yuradigan ikkilamchi antikorga, shuningdek, birlamchi antikor bilan bog'lanishi uchun bir muncha vaqt ruxsat beriladi, keyin yana bir yuvish bosqichi. Shundan so'ng, 3,3' Diaminobenzidin (DAB) qo'shiladi. HRP fermenti DAB substratini reaktsiya joyidagi to'qimalarda to'plangan jigarrang cho'kmaga aylantiradi va shu bilan birlamchi antikor o'z nishonini birinchi bo'lib bog'lagan joyning vizual tasvirini hosil qiladi.

    To'qimalarni tayyorlash

    To'qimalar eksperimentda markaziy rol o'ynaydi va epitoplar va to'g'ri morfologiya saqlanib qolishi uchun uni qayta ishlash muhim ahamiyatga ega. IHC uchun eng keng tarqalgan ishlov berish-formalin bilan biriktirilgan kerosinli (FFPE) to'qima bloklarini tayyorlash. Formalin fiksatsiyasining maqsadi to'qima ichidagi oqsillarning kimyoviy o'zaro bog'lanishini hosil qilishdir. Bu barcha uyali jarayonlarni to'xtatadi va fiksatsiya vaqtida bo'lgan joy va konformatsiyadagi uyali komponentlarni muzlatadi, shuningdek degradatsiyani oldini oladi. Tegishli fiksatsiyadan so'ng, to'qimalar qayta ishlanadi va oxir-oqibat kerosinli bloklarga joylashtiriladi, ular mikrotom yordamida ingichka bo'laklarga bo'linadi (odatda 4-10 mikrom). Bo'limlar shisha slaydlarga o'tkaziladi va keyingi ishlov berishdan oldin yopishtirishga ruxsat beriladi.

    Ba'zida fiksirovka qilish uchun formalindan tashqari boshqa usullar ham qo'llaniladi. Bularga boshqa turdagi aldegidlar yoki turli spirtli eritmalardan foydalanish kiradi. Fiksatorning eng yaxshi tanlovi ko'p jihatdan tahlilga bog'liq. FFPEga keng tarqalgan muqobil muzlatilgan to'qimalar namunalarini tayyorlashdir.Bunday holda, to'qimalar krioprotektiv muhitga joylashtiriladi va muzlatiladi va kesimdan keyin fiksatsiya qilinadi. Muzlatilgan to'qimalar kriostatlarga bo'linadi va qisqa ishlov berish vaqtlari va sezgir epitoplarni yaxshiroq saqlash afzalligi bor, lekin gistologik morfologiyani saqlab qolish nuqtai nazaridan ko'pincha FFPE to'qimalaridan past bo'lishi mumkin.

    Antigen (epitop) olish

    Formalin kabi fiksatorlarni o'zaro bog'lash yoki fiksator muhitda uzoq vaqt qolish bilan bog'liq muammo-bu asosiy antikorni nishonga bog'lanishiga to'sqinlik qiladigan epitoplarning niqobi. Ayniqsa, FFPE namunalari bilan, haqiqiy IHCga o'tishdan oldin, ko'pincha kimyoviy o'zaro bog'lanishning bir qismini qaytarish va epitoplarni "olib tashlash" kerak bo'ladi. Bir nechta antijenlarni qidirish protokollari mavjud va ularning asosiy strategiyalariga to'qima slaydini issiqlik, ovqat hazm qilish fermentlari, yuvish vositalari yoki ularning kombinatsiyasi bilan davolash kiradi. FFPE namunalarida antigen olishning eng keng tarqalgan usuli bu to'qima slaydlarini kislotali sitrat tamponida 15-20 daqiqa davomida bosim ostida qaynatishdir.

    Antikorlarni bog'lash

    Bog'lanish molekulasining sifati va o'ziga xosligi IHCga asoslangan har qanday texnikada hal qiluvchi ahamiyatga ega va bog'lovchi tanlash tahlilning natijasiga, ishonchliligiga va, ehtimol, talqiniga bevosita ta'sir qilishi mumkin. Antikorlar IHC uchun ishlatiladigan eng keng tarqalgan bog'lanish-molekulalar turidir va ko'pchilik antikorlar qiziqishning to'g'ri molekulasini etarlicha aniqlashga qodir bo'lsa-da, ular o'z maqsadlari uchun o'ziga xosligi bilan juda farq qilishi mumkin. Shuning uchun yuqori o'ziga xoslikka ega bo'lgan antikorlar "ton-target" bog'lanishini izohlashda ishonchliroq bo'ladi, chunki ular kam yoki umuman "off-target" bog'lanishi yoki "fon" hosil qilmaydi. Kamroq o'ziga xos bo'lgan antikorlar ko'proq maqsaddan tashqari bog'lanishni keltirib chiqarishi mumkin va natijada paydo bo'lgan fon maqsadli signallarni to'g'ri talqin qilishga xalaqit berishi mumkin. Antikorlarning ikkita asosiy turi bor - poliklonal antikorlar, ular har xil maqsadli epitoplarni bog'laydigan va bir xil epitopni bog'laydigan monoklonal antikorlarning heterojen aralashmasi. Poliklonal antikorlar, odatda, bir maqsadda bir nechta epitoplarni aniqlash va bog'lash qobiliyati tufayli juda kuchli. Biroq, ular bog'laydigan epitoplar ko'pincha aniqlanmagan va epitopning o'ziga xos xususiyatlarining ko'pligi va maqsadga bog'liq bo'lmagan hodisalar va fon shovqinlari ehtimoli oshadi. Biroq, poliklonal antikorlarning kuchi foydali bo'lishi mumkin, chunki maqsadli molekula atrofidagi bog'lanish hodisalarining kontsentratsiyasi odatda potentsial fon shovqinidan ustun turadi. Kamchilik shundaki, poliklonal antikorlar odatda cheklangan resurslardir, chunki ular hayvonlar zardobidan olinadi. Monoklonal antikorlar, aksincha, ko'proq davomiylikka ega, chunki ular gibridoma hujayralarida ishlab chiqarilishi mumkin. Monoklonal antikorlar ham epitop bilan bog'lanish nuqtai nazaridan yaxshi aniqlanadi, lekin spetsifikligi past bo'lsa yoki maqsadli epitop kam bo'lsa, izohlash qiyin bo'lgan natijalarni berishi mumkin.

    Har bir tahlil uchun antikorlarning kontsentratsiyasini diqqat bilan optimallashtirish va titrlash kerak, chunki natija nafaqat antikorning o'ziga xosligi va maqsadga yaqinligiga, balki konsentratsiyaga va maqsadli va potentsial maqsadli epitoplarning mavjudligiga bog'liq. namuna Namunaga juda ko'p antikorlarni qo'shish, maqsadli epitop (lar) birlashtiruvchi moddalar bilan to'yinganidan keyin, nishondan tashqari, past yaqinlikdagi bog'lanish hodisalari sonini ko'paytiradi. Antikor kontsentratsiyasini pasaytirib, nishondan tashqaridagi bog'lanish hodisalari kamdan-kam uchraydi, chunki ular odatda nishonga bog'lanish hodisalariga qaraganda kamroq yaqinlikka ega. Kam ta'sirchan antikorlardan foydalanganda fonni kamaytirishga urinish xavfi shundaki, maqsadli signallar bir vaqtning o'zida noto'g'ri salbiy natija beradigan darajada zaiflashadi.

    Ba'zida IHC asosidagi texnikada ishlatiladigan boshqa turdagi biriktiruvchi molekulalarga affibodalar, peptidlar, antikor bo'laklari yoki boshqa kichik molekulalar kiradi.

    Aniqlash tizimlari

    IHCni bajarishdan maqsad eksperimental to'qima ichida maqsadni qaerdan topish mumkinligini vizual tasvirni olish va afzalroq, shuningdek, geterogen hujayralar populyatsiyalari va / yoki subhujayra lokalizatsiyasi o'rtasida maqsadni ifodalash naqshlari haqida ma'lumot olishdir. Bu 3.26 -rasmda keltirilgan, bu turli to'qima bo'linmalarini turli to'qimalarda tasavvur qilish uchun turli xil antikorlardan qanday foydalanilishini ko'rsatadi. Maqsad va antikorlarning o'zaro ta'sirini tasavvur qilish uchun, kuzatiladigan dog 'yoki signal chiqaradigan qandaydir aniqlash tizimi kerak. Tajribaga aniqlash tizimini joriy qilishning eng keng tarqalgan usuli-bu oldindan bog'langan muxbir molekulasini, ya'ni ferment yoki ftoroforni olib yuradigan ikkilamchi antikorlardan foydalanish. Ikkilamchi antikorlar, odatda, har xil turdagi hayvonlarning antikor molekulalariga qaratilgan. Misol uchun, agar birlamchi antikor quyonda ko'tarilgan bo'lsa, ikkinchi darajali antikor boshqa hayvonda ko'tarilishi va quyon antikorlariga qaratilgan bo'lishi kerak.

    3.26 -rasm. Murakkab to'qimalarda turli xil protein maqsadlarini ko'rish. O'ng ustunda chap ustunda mos keladigan tasvirlar kattalashtirilgan. IHC tasvirida to'rt xil antikorlar yordamida bo'yalgan inson qizilo'ngachining ketma-ket bo'limlari to'qima ichidagi va hujayra ichidagi bo'linmalar ichidagi turli xil protein ekspresyon modellarini to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash imkonini beradi. Yuqori rasmlar solishtirish uchun faqat gematoksilinga qarshi bo'yalgan. P63 antikori qizilo'ngach epiteliyasining bazal qismida joylashgan hujayralar populyatsiyasida hujayra yadrolarini bo'yadi. EGFR (Epidermal o'sish omili retseptorlari) antikori p63 kabi bir xil hujayra populyatsiyasini bo'yadi, ammo yadrolar o'rniga hujayra membranalarini bo'yadi. G6PD (glyukoza-6-fosfat dehidrogenaza) antikori qizilo'ngach epiteliya hujayralarining kengroq repertuarining sitoplazmasini, shuningdek, biriktiruvchi to'qimada joylashgan hujayralarni bo'yadi. Laminin (LAMB2) antikori faqat qizilo'ngach ostida joylashgan biriktiruvchi to'qimadagi hujayralar va tuzilmalarni bo'yadi.

    FFPE to'qimalarining namunalari uchun eng keng tarqalgan aniqlash usuli - antikorlarni bog'lash joyida rangli cho'kma hosil qilish uchun fermentativ reaktsiyalardan foydalanish. Keyin ikkilamchi antikorlar fermentni olib yuradi, masalan. horseradish peroxidase (HRP) yoki ishqoriy fosfataza (AP), 3,3 'Diaminobenzidin (DAB) yoki 5-bromo-4-xloro-3-indolil fosfat/ p-nitroblue tetrazolium xlorid (BCIP/ NBT) kabi xromogenlarni aylantirishga qodir. ) reaktsiya joyida to'qimalarda to'plangan jigarrang yoki mavimsi cho'kmalarga aylanadi. Xromogen dog'lar yorug'lik-mikroskopda kuzatiladi va odatda uzoq vaqt davomida juda barqaror bo'ladi, bu tajribani keyinchalik arxivlash yoki keyinroq ko'rib chiqish zarur bo'lganda foydali bo'ladi.

    Muzlatilgan to'qima bo'laklari uchun, to'g'ri to'lqin uzunlikdagi yorug'lik to'lqinlari qo'zg'alganda, ma'lum bir rangni (odatda yashil, qizil yoki ko'k) chiqaradigan florofor bilan bog'langan ikkilamchi antikorlardan foydalanish odatiy holdir. Bundan tashqari, floroforlar odatda uzoq vaqt barqaror emas. Ammo, ftoroforlardan foydalanishning afzalligi shundaki, ular bir xil maqsadda bir nechta nishonga bir necha antikorlarni sinab ko'rilgan, ikki tomonlama etiketkali tajribalarni o'tkazish uchun oson usulni taqdim etadi. Ikkilamchi antikorlar turli xil birlamchi antikorlarga yo'naltirilgan bo'lishi kerak, shuningdek, har xil floroforlarga biriktirilishi kerak. Keyin turli xil ikkilamchi antikorlar ularni turli to'lqin uzunlikdagi yorug'lik bilan ketma-ket qo'zg'atish orqali alohida kuzatiladi. Ushbu turli xil qo'zg'alish natijalari alohida tasvirlar (yoki rangli kanallar) sifatida saqlanadi va keyinchalik oqsillarni birgalikda lokalizatsiya qilish va hokazolarni aniqlash uchun qoplanishi mumkin.

    Aniqlash uchun muxbir tashuvchi ikkilamchi antikorlardan foydalanish o'z-o'zidan kuchaytiruvchi qadamdir, chunki bir nechta ikkilamchi antikorlar bitta asosiy antikorni bog'lay oladi, lekin ba'zida tajribaning signalini va sezuvchanligini oshirish uchun qo'shimcha kuchaytirish bosqichlari talab qilinadi. Bunday hollarda, ikkilamchi antikor o'rniga "bog'lovchi molekulalar" ni, masalan, biotin polimerlarini olib yurishi mumkin, ular keyingi bosqichlarda ko'proq ma'lumot beruvchi molekulalarni jalb qilishga qodir. Signallarni kuchaytirish strategiyasi ham fermentativ, ham floresan aniqlash usullari uchun foydalidir.

    Qarama -qarshi

    Xromogenlar yordamida immunohistokimyoviy bo'yash ko'pincha kontrastni kuchaytiradigan va gistologik xususiyatlarni kuzatishni osonlashtiradigan qarshi bo'yoqni qo'llashdan foyda oladi. FFPE namunalari uchun ishlatiladigan qarama-qarshi bo'yoqning eng keng tarqalgan turi bu gematoksilin bo'lib, u hujayra sitoplazmasini och mavimsi rangga bo'yaydi va hujayra yadrolarini quyuqroq mavimsi rangda bo'yadi, 3.26-rasmda ko'rsatilganidek. Floresan bo'yoqlari odatda gematoksilin bilan bo'yalmaydi, chunki aniqlash usuli yorug'lik mikroskopiga asoslanmagan. Buning o'rniga, floresans uchun qarshi bo'yoq olishning eng keng tarqalgan usuli 3.27 -rasmda ko'rsatilganidek, nuklein kislotalarni bog'laydigan lyuminestsent bo'yoqlar qo'shib, hujayra yadrolarini yorliqlashdir. Haqiqiy immunohistokimyoviy reaktsiyadan so'ng, namunani himoya qilish va uzoq muddat saqlash uchun yopishtirish va muhrlash qoladi. Eng keng tarqalgan usul-sotuvda mavjud bo'lgan qatronlar yordamida namuna qoplamasini yopishtirish.

    3.27 -rasm Mikroskop ostidagi endotelial hujayralar. Yadrolar DAPI bilan ko'k rangga bo'yalgan, mikrotubalar FITC bilan bog'langan antikor tomonidan yashil rang bilan belgilanadi va aktin filamentlari TRITC bilan bog'langan phalloidin bilan qizil rang bilan belgilanadi. Sigir o'pka arteriyasi endotelial hujayralari

    NIH ImageJ-Programmpaket-dan olingan rasm

    Maxsus misollar

    IHC tadqiqotda ham, klinik amaliyotda ham keng qo'llaniladi. Inson oqsili atlasi (HPA) loyihasi ko'plab to'qimalar, saraton va hujayralardagi inson proteomasining keng miqyosli xaritasiga erishish uchun yuqori o'tkazuvchanlik IHC qanday qo'llanilishining yorqin namunasidir. HPA loyihasida keng ko'lamli antikorlarni ishlab chiqarishning soddalashtirilgan zanjiri o'ziga xos antikorlarni ishlab chiqarishni osonlashtiradi, ular asosiy tavsiflash va tekshirish rejimidan o'tgandan so'ng, bitta tajriba davomida yuzlab to'qima yadrolarini o'z ichiga olgan to'qima mikroarraylarini muntazam ravishda bo'yash uchun ishlatiladi. HPA tomonidan qo'llaniladigan IHC tizimi asosan protokollarni standartlashtirish va mashinalar yordamida avtomatlashtirishga tayanadi, ammo har bir antikor uchun optimal titrlashni baholash antikor to'qimalarning to'liq to'plamida bo'yash uchun tasdiqlanishidan oldin qo'lda amalga oshiriladi. Har bir bo'yalgan to'qima yadrosi to'qimalar va hujayra turlarida immunohistokimyoviy bo'yashga nisbatan izohlanadi va keyin veb-portalda har kim tomonidan erkin ko'rish uchun yuqori aniqlikdagi rasm sifatida nashr etiladi.

    Klinik amaliyotda IHC asosan patologiyada shifokorlarga to'qimalarning namunalarini sog'lom va kasal holatlarga qarab baholash, tashxis qo'yish va saratonning har xil turlarining molekulyar turini aniqlashda yordam berish uchun ishlatiladi. IHC diagnostikada qo'llaniladigan o'ziga xos misol, patologlarga metastatik o'simta namunasi taqdim etilganda va asosiy o'simtaning to'qimalarining kelib chiqishi noma'lum. Bunday holatlarda patologlar to'qimalarga xos oqsillarni, masalan, prostata saratoni uchun prostata xos antijeni yoki ginekologik saraton uchun estrogen retseptorlari yoki oshqozon-ichak saratoni uchun sitokeratin 20 kabi turli xil antikorlar panelini ishlatadilar (Gremel va boshq., 2014). Keng tasnif tuzilgandan so'ng, birlamchi o'smaning kelib chiqishini aniqlash uchun qo'shimcha to'qima o'ziga xos antikorlari qo'llaniladi. Ushbu ma'lumot dori terapiyasi uchun eng yaxshi yoki eng to'g'ri strategiyani tanlash va / yoki radiatsiya terapiyasi va / yoki jarrohlik uchun asosiy o'simtani aniqlash uchun foydalidir.

    Tepaga qaytish

    3.3 Oqsil sintezi va ketma-ketligi

    Qattiq fazali oqsil sintezi

    Peptidlar bir aminokislotaning karboksil guruhining boshqasining aminokislotasiga kondensatsiyalanishi natijasida kimyoviy yo'l bilan sintezlanadi. Guruhni himoya qilish strategiyalari odatda turli xil aminokislotalar yon zanjirlari bilan kiruvchi nojo'ya reaktsiyalarning oldini olish uchun zarurdir. Kimyoviy peptid sintezi ko'pincha peptidning karboksil uchidan boshlanadi (C-terminali) va amino-terminali (N-terminali) tomon davom etadi. Tirik organizmlarda oqsil biosintezi (uzun peptidlar) teskari yo'nalishda sodir bo'ladi. Kimyoviy sintez bakteriyalarda ifodalanishi qiyin bo'lgan peptidlar ishlab chiqarishni, tabiiy bo'lmagan aminokislotalarni, peptid/oqsil orqa miya modifikatsiyasini va D-aminokislotalardan tashkil topgan D-oqsillarini sintezini osonlashtiradi.

    Laboratoriyada sintetik peptidlarni ishlab chiqarishning o'rnatilgan usuli qattiq fazali peptid sintezi (SPPS) deb nomlanadi. Robert Bryus Merrifild kashshof bo'lgan SPPS aminokislotalar hosilalarining erimaydigan gözenekli tayanchga ketma -ket reaktsiyalari orqali peptid zanjirini tez yig'ish imkonini beradi.

    Qattiq tayanch yangi paydo bo'ladigan peptid zanjiri bilan bog'laydigan reaktiv guruhlar (masalan, omin yoki gidroksil guruhlari) bilan ishlaydigan kichik, polimerik qatronli boncuklardan iborat. Peptid sintez davomida tayanchga kovalent biriktirilgan bo'lib qolganligi sababli, ortiqcha reagentlar va yon mahsulotlarni yuvish va filtrlash orqali olib tashlash mumkin. Ushbu yondashuv, har bir reaktsiya bosqichidan so'ng, mahsulot peptidini eritmadan ajratish uchun vaqt talab qiladigan izolyatsiyani chetlab o'tadi.

    N-terminal peptid zanjiriga ulanadigan har bir aminokislotani N-terminali va yon zanjirida yon zanjirga qarab Boc (kislota-labil) yoki Fmoc (asos-labil) kabi tegishli himoya guruhlari yordamida himoya qilish kerak. ishlatiladigan himoya strategiyasi (pastga qarang).

    Umumiy SPPS protsedurasi muqobil N-terminal himoyalanish va birikish reaktsiyalarining takrorlanadigan tsikllaridan biridir. Qatronni har bir qadam orasida yuvish mumkin. Birinchidan, qatronga aminokislota biriktiriladi. Keyinchalik, amin himoyasizlanadi va keyin ikkinchi aminokislotaning erkin kislotasi bilan birlashtiriladi. Ushbu tsikl kerakli ketma-ketlik sintez qilinmaguncha takrorlanadi. SPPS tsikllari, shuningdek, reaksiyaga kirishmagan aminokislotalarning uchlarini blokirovka qilish bosqichlarini ham o'z ichiga olishi mumkin. Sintez oxirida xom peptid qattiq tayanchdan ajraladi va bir vaqtning o'zida trifloroasetik kislota yoki nukleofil kabi kuchli kislotalar reagenti yordamida barcha himoya guruhlari chiqariladi. Mahsulotlar tomonidan eriydigan organik moddalarni olib tashlash uchun xom peptidni dietil efir kabi qutbsiz erituvchidan cho'ktirish mumkin. Xom peptidni teskari fazali HPLC yordamida tozalash mumkin. Ayniqsa, uzoqroq peptidlarni tozalash jarayoni qiyin bo'lishi mumkin, chunki mahsulotga juda o'xshash bo'lgan bir nechta qo'shimcha mahsulotlarning oz miqdorini olib tashlash kerak. Shu sababli MCSGP kabi uzluksiz xromatografiya jarayonlari tijorat sharoitida poklik darajasidan voz kechmasdan hosilni ko'paytirish uchun tobora ko'proq foydalanilmoqda.

    SPPS reaktsiya hosildorligi bilan cheklangan va odatda 70 aminokislota oralig'idagi peptidlar va oqsillar sintetik foydalanish chegaralarini kuchaytiradi. Sintetik qiyinchilik ham ketma-ketlikka bog'liq, odatda amiloidlar kabi agregatsiyaga moyil bo'lgan ketma-ketliklarni qilish qiyin. Uzunroq uzunliklarga tabiiy kimyoviy ligatsiya kabi ligatsiya yondashuvlari yordamida kirish mumkin, bu erda ikkita qisqaroq to'liq himoyalangan sintetik peptidlar eritmada birlashtirilishi mumkin.

    3.28-rasm (amin-funktsional) amid qatroni yordamida dipeptidning qattiq fazali sintezi. N-terminalli himoya guruhi (PG) ishlatilgan himoya guruh sxemasiga qarab Fmoc yoki Boc bo'lishi mumkin. Aminokislota yon zanjirlari (R1, R2 va boshqalar) ortogon himoyalangan.

    Edman degradatsiyasi yordamida oqsillarni ketma -ketligi

    Edman degradatsiyasi, Pehr Edman tomonidan ishlab chiqilgan, aminokislotalarni peptidda tartiblash usulidir. Bu usulda amino-terminal qoldiq etiketlanadi va boshqa aminokislota qoldiqlari orasidagi peptid aloqalarini buzmasdan peptiddan ajratiladi.

    3.29-rasm Edman degradatsiyasi sxemasi. Bu usulda fenil izotiyosiyanat zaryadsiz bo'lgan N-terminalli aminokislotalar bilan reaksiyaga kirishib, engil ishqoriy sharoitda tsiklik hosil qiladi. feniltiokarbamoil hosila. Keyin, kislotali sharoitda, terminal aminokislotaning bu hosilasi tiazolinon lotiniga bo'linadi. Keyin tiazolinon aminokislotasi tanlab organik erituvchiga chiqariladi va kislota bilan ishlov berilib, yanada barqaror feniltiogidantoin (PTH)- aminokislotalar hosilasi hosil bo'ladi, ularni xromatografiya yoki elektroforez yordamida aniqlash mumkin. Keyingi aminokislotalarni aniqlash uchun ushbu protsedura yana takrorlanishi mumkin.

    Edman degradatsiyasining asosiy kamchiligi shundaki, peptidlar bu tarzda ketma-ket 50 dan 60 gacha qoldiqlarga ega bo'lolmaydi (va amalda 30 dan kam). Peptid uzunligi cheklangan, chunki tsiklik derivatizatsiya har doim ham tugamaydi. Derivatizatsiya muammosini reaksiyani davom ettirishdan oldin katta peptidlarni kichikroq peptidlarga bo'lish orqali hal qilish mumkin. U har bir aminokislotaning samaradorligi 99% dan yuqori bo'lgan zamonaviy mashinalari bilan 30 tagacha aminokislotalarni aniq tartiblay oladi. Edman degradatsiyasining afzalligi shundaki, u ketma-ketlik jarayoni uchun faqat 10-100 piko-mol peptiddan foydalanadi. Edman degradatsiyasi reaktsiyasi 1967 yilda Edman va Beggs tomonidan jarayonni tezlashtirish uchun avtomatlashtirilgan va 1973 yilga kelib butun dunyo bo'ylab 100 ta avtomatlashtirilgan qurilmalar qo'llanilgan.

    Edman degradatsiyasi oqsilning N-terminalidan kelib chiqqanligi sababli, agar N-terminali kimyoviy jihatdan o'zgartirilgan bo'lsa (masalan, atsetillanish yoki piroglutamik kislota hosil bo'lishi) ishlamaydi. Agar alfa-aminokislotalarga (masalan, isoaspartik kislota) duch kelsangiz, ketma-ketlik to'xtaydi, chunki beshta a'zoli halqali oraliq hosil bo'lolmaydi. Edman degradatsiyasi odatda disulfid ko'priklarining o'rnini aniqlash uchun foydali emas. Bundan tashqari, aniq natijalarga erishish uchun 1 pikomol yoki undan yuqori peptid miqdorini talab qiladi.

    2D SDS PAGE dan so'ng oqsillarni keyingi tahlil qilish uchun poliviniliden diftorid (PVDF) tozalash membranasiga o'tkazish mumkin. Edman degradatsiyasi to'g'ridan -to'g'ri PVDF membranasidan amalga oshirilishi mumkin. N-terminal qoldiqlari ketma-ketligi beshdan o'ntagacha aminokislotaga olib keladi, bu qiziqish oqsilini (POI) aniqlash uchun etarli bo'lishi mumkin.

    Matrix yordamida lazer desorbsiyasi/ionlanish-parvoz vaqti (MALDI-TOF) mass-spektrometriyasi bo'yicha ketma-ketlikni tahlil qilish.

    Mass-spektrometriya- har xil kimyoviy elementlarning tarkibini va atom yadrolarini massa-zaryad nisbati (m/z) bo'yicha bo'linishini yuqori aniqlikda tahlil qilish usuli. U birikma hosil qiluvchi turli xil kimyoviy elementlarni aniqlashda yoki bir xil tarkibdagi turli elementlarning izotopik tarkibini aniqlashda ishlatilishi mumkin.

    Protein massasi spektrometriyasioqsillarni o'rganishda mass -spektrometriya qo'llanilishini bildiradi. Mass-spektrometriya oqsillarning massasini aniq aniqlash va tavsiflashning muhim usuli bo'lib, undan ko'p foydalanish uchun turli usullar va asboblar ishlab chiqilgan.Uning qo'llanilishi oqsillarni aniqlash va ularning post-translyatsion modifikatsiyasini, oqsil komplekslarini, ularning bo'linmalari va funktsional o'zaro ta'sirlarini, shuningdek proteomikada oqsillarni global o'lchashni o'z ichiga oladi. Bundan tashqari, u oqsillarni turli organellalarda lokalizatsiya qilish va turli oqsillar hamda membrana lipidlari bilan o'zaro ta'sirini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.

    Suyuq va qattiq biologik namunalarda ko'pincha ikkita usuldan foydalaniladi: elektro purkash ionlashi va lazer matritsali lazerli desorbsiya/ionlash (MALDI). MALDIda ionlashtiruvchi analitiklar mos matritsa bilan kristallanadi va lazer ta'sirida ionlarga aylanadi. Ushbu ionlanish manbai, odatda, uchish analizatori (TOF) vaqti bilan bog'liq bo'lib, bunda ionlar elektr maydonida tezlashtirilgandan keyin ularning massa zaryadiga ko'ra ajratiladi. Nihoyat, massa spektrometri detektori ion yuzadan o'tganda yoki urilganda hosil bo'lgan zaryad yoki oqimni qayd qiladi. Har bir oqsil uchun massa spektri qayd etiladi (3.30-rasm).

    3.30 -rasm. MALDI-TOF MS tomonidan oqsillarni aniqlash. MALDI-TOF MS tahlilini (A), so'ngra MS/MS peptidlarining parchalanishini (B) va MASCOT ma'lumotlar bazasini qidirish algoritmi (C) yordamida spektral ma'lumotlarni tahlil qilishni ishlab chiquvchi oqsillarni aniqlash ishi.

    Umuman olganda, oqsillar "yuqoridan pastga" usulida tahlil qilinadi, bunda oqsillar buzilmagan holda tahlil qilinadi yoki "pastdan yuqoriga" usulida oqsillar birinchi bo'lib parchalanadi. Ba'zida peptidning katta bo'laklari tahlil qilinadigan oraliq va past darajali yondashuvdan ham foydalanish mumkin. Biroq, yuqoridan pastga yondashuv asosan butun oqsillarni qayta ishlash, ularning heterojenligi va tahlillarining murakkabligi bilan bog'liq muammolar tufayli past o'tkazuvchanlikdagi yagona oqsilli tadqiqotlar bilan cheklangan.

    "pastdan yuqoriga" MS deb ataladigan ikkinchi yondashuvda oqsillar fermentativ ravishda kichikroq peptidlarga proteaz yordamida hazm qilinadi. tripsin. Tripsinko'p sonli umurtqali hayvonlarning ovqat hazm qilish tizimida topilgan PA klan superfamiliyasidan olingan serin proteazadir, u erda oqsillarni gidrolizlaydi. Tripsin peptid zanjirlarini asosan lizin yoki arginin aminokislotalarining karboksil tomonida ajratadi, bundan keyin prolin ketmasa. U ko'plab biotexnologik jarayonlar uchun ishlatiladi. Jarayon odatda tripsin proteolizi yoki tripsinizatsiyasi deb ataladi va tripsin bilan hazm qilingan/muomala qilingan oqsillar tripsinlangan deb ataladi.

    Keyinchalik, bu peptidlar mass -spektrometrga kiritiladi va peptid massasi barmoq izlari yoki tandem mass -spektrometriyasi yordamida aniqlanadi. Shunday qilib, bu yondashuv peptidlar darajasida identifikatsiyadan foydalanadi va ular bilan biriktirilgan oqsillarning mavjudligini aniqlaydi de novo takroriy aniqlash. Kichikroq va bir xil bo'laklarni buzilmagan oqsillarga qaraganda tahlil qilish osonroq va ularni yuqori aniqlik bilan aniqlash mumkin, shuning uchun bu & quot; pastdan yuqoriga & quot; yondashuvi proteomikani o'rganishning afzal qilingan usuli hisoblanadi. Foydali bo'layotgan yana bir yondashuv-bu oraliq va past darajali yondashuv bo'lib, unda odatda triptik peptidlardan kattaroq proteolitik peptidlar tahlil qilinadi.

    Qiziqarli oqsillar, odatda, biologik muhitda birgalikda mavjud bo'lgan bir nechta oqsil va molekulalarning murakkab aralashmasining bir qismidir. Bu ikkita muhim muammoni ko'rsatadi. Birinchidan, katta molekulalar uchun ishlatiladigan ikkita ionlash usuli faqat aralashmada taxminan teng miqdordagi tarkibiy qismlar bo'lganida yaxshi ishlaydi, biologik namunalarda esa har xil oqsillar har xil miqdorda bo'ladi. Agar bunday aralashma elektrosprey yoki MALDI yordamida ionlashtirilsa, ko'proq turlar kamroq bo'lganlarning signallarini "cho'kish" yoki bostirishga moyil bo'ladi. Ikkinchidan, murakkab aralashmaning massa spektrini aralashma komponentlarining ko'pligi tufayli talqin qilish juda qiyin. Proteinning fermentativ hazm bo'lishi natijasida ko'p miqdordagi peptidli mahsulotlarning paydo bo'lishi haqiqatni yanada kuchaytiradi.

    Bu muammolarni hisobga olgan holda, oqsillarni ajratishda bir va ikki o'lchovli gel elektroforez va yuqori samarali suyuq xromatografiya usullari keng qo'llaniladi. Birinchi usul ikki o'lchovli gel elektroforez orqali butun oqsillarni fraksiyalarga ajratadi (3.31-rasm). 2D jelning birinchi o'lchami-izoelektrik fokuslash (IEF). Bu o'lchovda oqsil izoelektrik nuqtasi (pI) bilan ajralib turadi, ikkinchi o'lchami-SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE). Bu o'lchov oqsilni molekulyar og'irligiga qarab ajratadi. Ushbu bosqich tugagandan so'ng, jel ichidagi hazm qilish sodir bo'ladi.

    Ba'zi hollarda ushbu usullarning ikkalasini birlashtirish kerak bo'lishi mumkin. 2D gelda aniqlangan jel dog'lari odatda bitta oqsilga tegishli. Proteinning identifikatori zarur bo'lsa, odatda jel ichidagi hazm qilish usuli qo'llaniladi, bu erda qiziqishdagi oqsil nuqtasi kesiladi va proteolitik tarzda hazm qilinadi. Ovqat hazm qilish natijasida hosil bo'lgan peptid massalarini peptid massasi barmoq izlari yordamida massa spektrometriyasi orqali aniqlash mumkin. Agar bu ma'lumot oqsilni aniq aniqlashga imkon bermasa, uning peptidlari tandem mass -spektrometriya o'tkazilishi mumkin. de novo ketma-ketlik. 2D-PAGE yordamida massa va zaryaddagi kichik o'zgarishlarni aniqlash mumkin. Ushbu texnikaning kamchiliklari uning boshqa usullarga nisbatan kichik dinamik diapazonidir, ba'zi oqsillarni kislotaligi, asosliligi, hidrofobikligi va hajmi (juda katta yoki juda kichik) tufayli ajratish hali ham qiyin.

    Ikkinchi usul, yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi fermentativ hazm qilishdan keyin peptidlarni fraksiyalash uchun ishlatiladi. HPLC/MS yordamida oqsil aralashmalarining tavsifi ov miltig'i proteomikasi va MuDPIT (ko'p o'lchovli oqsillarni aniqlash texnologiyasi) deb ham ataladi. Protein aralashmasining hazm bo'lishi natijasida hosil bo'lgan peptid aralashmasi suyuq xromatografiyaning bir yoki ikki bosqichida fraktsiyalanadi. Xromatografiya bosqichidagi elyutorni elektr spreyi ionlash orqali mass -spektrometrga to'g'ridan -to'g'ri kiritish mumkin yoki keyinchalik MALDI yordamida massa tahlil qilish uchun bir qancha mayda joylarga qo'yish mumkin.

    3.31 -rasm. Mass -spektrometriya yordamida oqsillarni barmoq izlari bilan chizish. Protein aralashmalari hujayra madaniyati yoki tussi namunalaridan tayyorlanadi va jel elektroforezi bilan ajratiladi. Peptid aralashmasini ishlab chiqarish uchun yagona oqsillar tripsin yordamida ajratiladi va hazm qilinadi. Peptidlar suyuq xromatografiya yordamida ajratiladi va mass -spektrometriya yordamida tahlil qilinadi

    Tepaga qaytish

    3.4 Proteinlar tuzilishini tushuntirish

    X-nurli kristallografiya

    Proteinli rentgen nurlari kristallografiyasi ma'lum bir oqsilning uch o'lchovli tuzilishini uning kristallangan shaklining rentgen nurlari diffraktsiyasi yordamida olish uchun ishlatiladigan usul. Bu uch o'lchovli struktura oqsilning funksionalligini aniqlashda hal qiluvchi ahamiyatga ega. Kristallar yasash panjara hosil qiladi, bu usul ma'lumotlar to'plamini sezgirroq qilish uchun millionlab oqsil molekulalarini birlashtiradi. Bu xuddi qog'ozlar to'plamini olish, o'lchagich bilan kengligi o'lchash va bitta qog'ozning kengligini aniqlash uchun bu uzunlikni sahifalar soniga bo'lish kabi. Ushbu o'rtacha texnikada shovqin darajasi pasayadi va signalning shovqin nisbati ortadi. Proteinning faol joylari va bog'lanish joylarining o'ziga xosligi butunlay oqsilning aniq konformatsiyasiga bog'liq. Protein tuzilishidan tashqari, boshqa biologik molekulalarni rentgen kristallografiyasi yordamida tekshirish mumkin. Rozalind E.Franklinning rentgen kristallografiyasi J.D.Uotson va F.H.C. DNKning qo'sh spiral tuzilishini aniqlash uchun Krik.

    Rentgen kristallografiyasi minglab oqsillarning batafsil uch o'lchovli tuzilishini ochib beradi. X-ray kristallografik tahlilining uchta komponenti-oqsil kristalli, rentgen nurlari manbai va detektor.

    X-nurli kristallografiya ular o'rganayotgan molekulalarning qattiq kristallari o'sishi orqali molekulyar tuzilmalarni o'rganish uchun ishlatiladi. Kristallograflar yuqori quvvatli rentgen nurlarini trillionlab bir xil molekulalarni o'z ichiga olgan kichkina kristalga qaratadilar. Kristal rentgen nurlarini elektron detektorga tarqatadi. Raqamli kamerada tasvirni olish uchun elektron detektor ham xuddi shunday. Bir necha soniyadan bir necha soatgacha davom etadigan rentgen nurlarining har bir portlashidan so'ng, tadqiqotchilar kristallni rentgen apparatini boshqaradigan kompyuterga kerakli yo'nalishni kiritish orqali aniq aylantiradilar. Bu olimlarga kristalning rentgen nurlari qanday tarqalishini yoki tarqalishini uch o'lchovda tasvirlashga imkon beradi. Har bir diffraktsion nurning intensivligi kompyuterga beriladi, u kristallangan molekuladagi har bir atomning o'rnini hisoblash uchun matematik tenglamadan foydalanadi. Natijada molekulaning uch o'lchovli raqamli tasviri paydo bo'ladi (3.32-rasm).

    Kristallograflar angstromlarda atomlar orasidagi masofani o'lchaydilar. Angstrom masofalarini o'lchash uchun mukammal &ldquorulers&rdquo rentgen nurlaridir. Kristallograflar ishlatadigan rentgen nurlari uzunligi 0,5 dan 1,5 angstromgacha, ular molekuladagi atomlar orasidagi masofani o'lchash uchun to'g'ri o'lchamdir. Agar radiatsiya to'lqin uzunligi kovalent bog'lanishning bog'lanish uzunligidan ancha katta yoki kichikroq bo'lsa, yorug'lik tarqalmaydi va tuzilish haqida yangi ma'lumotga ega bo'lmaydi. Shuning uchun rentgen nurlari qo'llaniladi.

    3.32-rasm Molekula strukturasini rentgen kristallografiyasi yordamida yechish ish jarayoni

    dan rasm Tomas Spletsttoesser

    Jarayon qiziqish oqsilining kristallanishi bilan boshlanadi. Proteinning kristalizatsiyasi barcha oqsil atomlarining bir -biriga nisbatan yo'naltirilgan yo'nalishiga olib keladi va shu bilan birga biologik faol konformatsiyasini saqlab qoladi - rentgen nurlanishining buzilishi. Protein cho'ktirilishi yoki eritmadan olinishi kerak. Bu erda asosiy qoida ko'plab kristallarni o'stirish uchun iloji boricha toza protein olishdir (bu kristallarning zaryadlangan xususiyatlarga ega bo'lishiga va tarqalish natijalarini yaxshilash uchun sirt zaryadli taqsimlanishiga imkon beradi). Protein kristallanishiga erishish uchun 4 ta muhim qadam qo'yiladi:

    1. Proteinni tozalang. Proteinning tozaligini aniqlang va agar toza bo'lmasa (odatda & gt99%), keyin keyingi tozalashdan o'tishi kerak.
    2. Proteinni cho'ktirish kerak. Odatda bu oqsilni tegishli erituvchida (suv-bufer eritmasi, organik tuz, masalan, 2-metil-2,4-pentandiol) eritish orqali amalga oshiriladi. Agar oqsil suv buferida yoki organik buferda erimasa, natriy lauril sulfat kabi yuvish vositasini qo'shish kerak.
    3. Eritmani supersaturatsiyaga keltirish kerak (oqsilni erituvchining qolgan qismidan kondensatsiya yadrolarini hosil qilish). Bu oqsilning konsentrlangan eritmasiga tuz qo'shilishi, uning eruvchanligini pasaytirish va oqsilning yuqori darajada uyushgan kristal hosil qilishiga imkon berish orqali amalga oshiriladi (bu jarayon tuzlanish deb ataladi). Boshqa usullarga partiyaviy kristallanish, suyuqlik-suyuqlik kristallanish, bug 'diffuziyasi va dializ kiradi.
    4. Haqiqiy kristallar o'sib chiqsin. Yadro kristallari hosil bo'lganligi sababli, bu haqiqiy kristal o'sishiga olib keladi.

    Keyin kristallar rentgen nurlari bilan bombardimon qilinadi, diffraktsiya naqshlari qayd qilinadi va struktura Furye transformatsiyasi yordamida diffraktsiya qolipidan qayta konfiguratsiya qilinadi. Furye konvertatsiyasi orqali elektron zichligining taqsimoti er xaritasi kabi bir -birining ustiga qo'yilgan parallel shakllar va chiziqlar qatori sifatida tasvirlangan. Xarita rentgen kristallografiyasi orqali kuzatilgan elektron zichliklarining uch o'lchovli tasvirini beradi. Elektron zichlik xaritasini sharhlashda rezolyutsiyani hisobga olish kerak. 5 va Aring - 10 va Aring rezolyutsiyalari polipeptid zanjirlarining tuzilishini, 3 va Aring - 4 va atomlar guruhlari va 1 va Aring - 1,5 va Aring individual atomlarining tuzilishini ochib beradi. Ruxsat berish kristalning tuzilishi bilan cheklangan va oqsillar uchun taxminan 2 & Aring.

    Giyohvand moddalarni kashf qilish va tibbiyot sohasidagi ko'plab yutuqlar, asosan, rentgen kristallografiyasi yordamida, bugungi kunda rivojlanayotgan ko'plab kasalliklarning dori maqsadlarini aniqlab beradi. Masalan, 80-yillarning oxirlarida olimlar retrovirusning hayot aylanishi uchun muhim bo'lgan OIV proteazasining tuzilishini ishlab chiqarish uchun rentgen kristallografiyasidan foydalanishda yutuq yaratishdi. Ferment pishmagan virusli hujayralarning asosiy tarkibiy qismlari bo'lgan virusli oqsillarni alohida etuk oqsillarga ajratadi, ular etuk va yuqumli virusli zarrachalarni hosil qilishda davom etishi mumkin. Uning tuzilishiga, xususan uning simmetriyasiga diqqat bilan qaragan holda, tadqiqotchilar fermentning yopilishi va uning to'g'ri ishlashiga yo'l qo'ymaslik uchun uning nosimmetrik yarmining o'rtasida joylashgan fermentning faol joyi bilan o'zaro ta'sir o'tkazadigan birikmalar hosil qila boshladilar. Ajablanarlisi shundaki, 90-yillarning o'rtalariga kelib, OITS virusidan o'lim darajasini keskin kamaytiruvchi uchta OIV proteaz inhibitori dori bozorda edi (3.33-rasm).

    3.33 -rasm. Ommaviy D-enantiomerining OIV-1 PR kristalli tuzilishi jami tayyorlangankimyoviy sintez D-MVT101 inhibitori bilan birlashtirilgan. (a) kokristallar 50% ammoniy sulfatdan, pH 5.4, P212121a = 67.5, b = 92.8, c = 29.4 va Aring kosmik guruhida olingan. (b) D OIV-1 PR ning C&alfa kuzatuvining stereo ko'rinishi. Bog'langan D MVT-101 inhibitori yashil rangli tayoqchalar bilan ko'rsatilgan. Koordinatalar OIVning Strukturaviy ma'lumotlar bazasiga48 kirish kodi: NCI2009 ga joylashtirildi.

    Tepaga qaytish

    Yadro magnit -rezonans (NMR) tasviri

    Proteinlarning yadro magnit -rezonansli spektroskopiyasi (odatda qisqartiriladi oqsil NMR) - bu strukturaviy biologiya sohasi bo'lib, unda oqsillarning tuzilishi va dinamikasi, shuningdek nuklein kislotalari va ularning komplekslari haqida ma'lumot olish uchun NMR spektroskopiyasi qo'llaniladi. Bu sohani Richard R. Ernst va Kurt V & uumlthrich ETHda, Ad Bax, Marius Klor va Angela Gronenborn NIHda va boshqalarda kashshof bo'lgan. NMR spektroskopiyasi yordamida tuzilmani aniqlash odatda bir necha bosqichlardan iborat bo'lib, ularning har biri alohida ixtisoslashgan texnikani o'z ichiga oladi. Namuna tayyorlanadi, o'lchovlar o'tkaziladi, sharhlovchi yondashuvlar qo'llaniladi va struktura hisoblab chiqiladi va tasdiqlanadi.

    NMR atomning markaziy yadrosining (& quotnucleus & quot) kvant mexanik xususiyatlarini o'z ichiga oladi. Bu xususiyatlar mahalliy molekulyar muhitga bog'liq va ularning o'lchami atomlarning kimyoviy bog'lanishi, kosmosda qanchalik yaqinligi va ular bir -biriga nisbatan tez harakatlanishining xaritasini beradi. Bu xususiyatlar ko'proq tanish bo'lgan magnit-rezonans tomografiyada (MRI) qo'llaniladigan xususiyatlar bilan tubdan bir xil, ammo molekulyar ilovalar o'lchovni millimetrdan (radiologlar uchun qiziq) nanometrlarga (bog'langan atomlar) o'zgartirishga mos keladigan biroz boshqacha yondashuvdan foydalanadi. odatda nanometrning bir qismi). O'lchovning bunday o'zgarishi aniqlanishning yuqori sezuvchanligini va uzoq muddatli o'lchash uchun barqarorlikni talab qiladi. MRIdan farqli o'laroq, strukturaviy biologiya tadqiqotlari tasvirni to'g'ridan-to'g'ri yaratmaydi, balki uch o'lchovli molekulyar modellarni yaratish uchun kompyuterning murakkab hisob-kitoblariga tayanadi.

    Hozirgi vaqtda ko'pchilik namunalar suvdagi eritmada tekshiriladi, ammo qattiq namunalar bilan ishlash usullari ishlab chiqilmoqda. Ma'lumot to'plash namunani kuchli magnit ichiga joylashtirishga, namuna orqali radiochastota signallarini yuborishga va bu signallarning yutilishini o'lchashga asoslanadi. Protein tarkibidagi atomlarning muhitiga qarab, alohida atomlarning yadrolari radio signallarining turli chastotalarini o'zlashtiradi. Bundan tashqari, turli yadrolarning yutilish signallari qo'shni yadrolar tomonidan bezovtalanishi mumkin. Bu ma'lumot yordamida yadrolar orasidagi masofani aniqlash mumkin. Bu masofalar o'z navbatida oqsilning umumiy tuzilishini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.

    Oddiy tadqiqot ikkita oqsilning bir-biri bilan o'zaro ta'sirini o'z ichiga olishi mumkin, ehtimol ular o'zaro ta'sirning normal biologiyasini ("kimyoviy biologiya") tekshirish yoki farmatsevtikada foydalanish uchun (dorilarni ishlab chiqish) mumkin bo'lgan yo'nalishlarni ta'minlash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan kichik molekulalarni ishlab chiqish maqsadida. Ko'pincha o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillar juftligi inson genetikasi tadqiqotlari natijasida aniqlangan bo'lishi mumkin, bu o'zaro ta'sir noqulay mutatsiyalar tufayli buzilishi mumkinligini ko'rsatadi yoki ular "model" organizmlarning normal biologiyasida asosiy rol o'ynashi mumkin, masalan, meva chivinlari, xamirturushlar, xamirturushlar. qurt C. elegans, yoki sichqonlar.

    Protein yadro magnit rezonansi yuqori darajada tozalangan oqsilning suvli namunalarida amalga oshiriladi. Odatda, namuna 0,1 va ndash 3 millimolyar oralig'ida 300 dan 600 mikrolitrgacha bo'lgan oqsil konsentratsiyasidan iborat. Protein manbai tabiiy bo'lishi mumkin yoki gen muhandisligi orqali rekombinant DNK texnikasi yordamida ishlab chiqarish tizimida ishlab chiqarilishi mumkin. Rekombinant tarzda ifodalangan oqsillarni etarli miqdorda ishlab chiqarish odatda osonroq bo'ladi va bu usul izotopik belgilarni yaratishga imkon beradi.

    Tozalangan oqsil odatda bufer eritmasida eritiladi va kerakli erituvchi sharoitlariga moslashtiriladi. NMR namunasi ingichka devorli shisha naychada tayyorlanadi. (3.34 -rasm)

    3.34-rasm NMR namunasi ingichka devorli shisha quvurda tayyorlanadi

    Belgilanmagan oqsil bilan korrelyatsion spektroskopiya (COZY) orqali ikki o'lchovli bir yadroli yadroli magnit -rezonansli tajribalarni yozib olish odatiy protsedura bo'lib, ulardan bir nechtasiga an'anaviy korrelyatsion spektroskopiya kiradi. umumiy korrelyatsiya spektroskopiya (TOCSY) va yadroli Overhauser effektli spektroskopiya (NOESY). Ikki o'lchovli yadro magnit-rezonans tajribasi ikki o'lchovli spektrni hosil qiladi. Ikkala o'qning birliklari kimyoviy siljishlardir. COZY va TOCSY magnitlanishni qo'shni protonlar orasidagi kimyoviy bog'lanish orqali uzatadi (3.35-rasm). An'anaviy korrelyatsion spektroskopiya tajribasi faqat qo'shni atomlardagi protonlar orasidagi magnitlanishni o'tkazishga qodir, umumiy korrelyatsion spektroskopiyada esa protonlar magnitlanishni o'tkaza oladi, shuning uchun u qo'shni atomlar bilan bog'langan barcha protonlar orasida o'tkaziladi. An'anaviy korrelyatsion spektroskopiyada alfa proton magnitlanishni beta protonlariga o'tkazadi, beta protonlari alfa va gamma protonlariga o'tkaziladi, agar mavjud bo'lsa, gamma protoni beta va delta protonlariga o'tadi va jarayon davom etadi. . Umumiy korrelyatsiya spektroskopiyasida alfa va boshqa barcha protonlar, agar ular protonlarning uzluksiz zanjiri bilan bog'langan bo'lsa, magnitlanishni beta, gamma, delta, epsilonga o'tkazishga qodir. Protonlarning uzluksiz zanjiri individual aminokislotalarning yon zanjiridir.

    Shunday qilib, bu ikkita tajriba spin tizimlarini qurish uchun ishlatiladi, ya'ni peptid protonining, alfa protonlarining va har bir qoldiqdan qolgan barcha protonlarning kimyoviy siljishining rezonanslari ro'yxatini tuzish uchun ishlatiladi. Qaysi kimyoviy siljishlar spin tizimidagi qaysi yadrolarga to'g'ri keladi, korrelyatsion spektroskopik bog'lanishlar va har xil turdagi protonlarning o'ziga xos kimyoviy siljishlarga ega bo'lishi bilan belgilanadi.Turli spin tizimlarini ketma-ket ulash uchun yadroviy Overhauser effekti spektroskopiyasi tajribasidan foydalanish kerak. Ushbu tajriba magnitlanishni kosmosga o'tkazganligi sababli, u bir xil spin tizimida yoki yo'qligidan qat'i nazar, kosmosda yaqin bo'lgan barcha protonlar uchun o'zaro to'qnashuvlarni ko'rsatadi. Qo'shni qoldiqlar kosmosda juda yaqin joylashgan, shuning uchun topshiriqlar NOESY cho'qqilari tomonidan boshqa aylanish tizimlari bilan amalga oshirilishi mumkin.

    3.35-rasm: Glutamat yoki metionin kabi aminokislotalar uchun COZY va TOCSY 2D spektrlarini solishtirish. TOCSY spektrdagi barcha protonlar orasidagi diagonali o'zaro bog'liqliklarni ko'rsatadi, lekin COZYda faqat qo'shnilar o'rtasida kesishishlar mavjud.

    Gomonukulyar yadro magnit rezonansidan foydalanishning muhim muammolaridan biri bu cho'qqilar orasidagi o'zaro bog'liqlikdir. Bu har xil protonlar bir xil yoki juda o'xshash kimyoviy siljishlarga ega bo'lganda sodir bo'ladi. Protein kattalashgan sari bu muammo yanada kuchayadi, shuning uchun homonukleer yadroli magnit -rezonans odatda kichik oqsillar yoki peptidlar bilan chegaralanadi.

    Agar rekombinant oqsillarni ishlab chiqarish mumkin bo'lsa, natijada paydo bo'ladigan oqsilni nitrogen-15 yoki uglerod-13 bilan belgilash mumkin, bu esa batafsilroq tajriba o'tkazish imkonini beradi, masalan, heteronukleer yagona kvantli kogerentlik spektroskopiyasi (HSQC). Eng ko'p bajariladigan 15N tajribasi 1 H-15 N HSQC. Tajriba juda sezgir va shuning uchun nisbatan tez bajarilishi mumkin. NMR yordamida tuzilmani aniqlash uchun, shuningdek, namuna sharoitlarini optimallashtirish uchun oqsilning yaroqliligini tekshirish uchun ishlatiladi. Bu oqsilning eritma strukturasini aniqlash uchun qo'llaniladigan standart tajriba to'plamidan biridir. HSQC ni uch va to'rt o'lchovli NMR tajribalariga, masalan, 15 N-TOCSY-HSQC va 15 N-NOESY-HSQC kabi kengaytirish mumkin (3.36-rasm).

    1 H & ndash NleG3-2 izotopik yorliqli oqsil fragmentining 15 N HSQC spektri. Spektrdagi har bir cho'qqi bir-biriga bog'langan N-H juftligini ifodalaydi, uning ikkita koordinatasi H va N atomlarining har birining kimyoviy siljishlariga mos keladi. 1 H & ndash NleG3-2 izotopik yorliqli oqsil fragmentining 15 N HSQC spektri. Spektrdagi har bir tepalik bog'langan N-H juftligini ifodalaydi, uning ikkita koordinatasi H va N atomlarining har birining kimyoviy siljishiga mos keladi.

    3.36-rasm 1 H & ndash NleG3-2 izotopik yorliqli oqsil fragmentining 15 N HSQC spektri. Spektrdagi har bir cho'qqi bir-biriga bog'langan N-H juftligini ifodalaydi, uning ikkita koordinatasi H va N atomlarining har birining kimyoviy siljishlariga mos keladi.

    Rasm: Wu, B., va boshqalar. al. (2010) PLoS patogenlari 6(6):e1000960.

    Krioelektron mikroskopiya

    Kriogen-elektron mikroskopiya (kriyo-EM) so'nggi paytlarda strukturaviy biologiyada makromolekulyar tuzilmalarning yuqori aniqlikdagi zichlik xaritalarini taqdim etishga qodir kuchli texnika sifatida paydo bo'ldi (3.37-rasm). 1,5 Å ga yaqinlashadigan ruxsatlar endi mumkin va 1&ndash4-Å diapazonidagi xaritalar yuqori darajadagi ishonchlilik bilan atomistik modellarni qurish haqida xabar beradi. Tergovchilarning makromolekulyar tuzilmalarni yuqori aniqlikda va kristallogenezga ehtiyoj sezmagan holda aniqlashning yangi qobiliyati krio-EMni qabul qilishga qiziqishning portlashiga olib keldi.

    Protein suspenziyalari o'tkazgichli materialdan (masalan, Cu yoki Au) 3 mm diametrli perforatsiyali 1 va ndash2 va mumli perforatsiyali muntazam plyonka bilan qoplangan 3 mm diametrli transmisyon-elektron mikroskopi (TEM) tayanch panjaralarida muzlatiladi. To'rga jami 3&ndash5 ml namuna yuklanadi, so'ngra filtr qog'ozi bilan filtr qog'ozi bilan tozalanadi, bu muzlatilganida elektron nurning kirib borishi uchun etarlicha yupqa bo'ladigan bufer/oqsil plyonkasini hosil qilish uchun. Muzning qalinligini optimallashtirish namuna tayyorlashda muhim qadamdir, chunki muzning qalinroq qatlamlari tushgan elektronning bir nechta sochilish hodisalariga duch kelish ehtimolini oshiradi va shu bilan tasvir sifatini pasaytiradi. Muzning haddan tashqari qalinligida elektron nurlar umuman kirmaydi. Tugatgandan so'ng, tarmoq tezda etan va mdasha suyuq vannasiga tushiriladi, bu muz kristallari paydo bo'lishining oldini olish uchun suvni tez tez muzlatadi. Muzli vitreus qatlamining hosil bo'lishi krio-EMning asosiy bosqichi bo'lib, nishonni yaqin-atrofda saqlaydi. Olingan oqsil molekulalari bo'lgan shishasimon muz qatlami TEMda saqlash va tasvirlash jarayonida yuqori sifatli tasvirlash va oqsilni saqlashga mos bo'lmagan boshqa muz turlarining fazaviy o'zgarishlarini oldini olish uchun suyuq azot haroratiga (va minus & thinsp196 & degC) yaqin bo'lishi kerak. tuzilish

    Krio-EMda tasvirning shakllanishi, asosan, fazaviy kontrast bilan amalga oshiriladi, garchi tasvir kontrastining 7 dan 10% gacha amplitudali kontrastdan. Amplitudali kontrast, agar elektron shunchalik tarqoq bo'lsa, u TEM ustuni bo'ylab diafragma yoki energiya filtri orqali chiqariladi, odatda hisobga olinmaydi, chunki olingan ma'lumot fazali kontrast bilan solishtirganda past aniqlikda bo'ladi.

    3.37-rasm Krio-elektron mikroskopi. (a) Shotlandiya makromolekulyar tasvirlash markazi JEOL CryoARM 300. (b) Lumazin sintazasining yuqori aniqlikdagi 2.2-Å rezolyutsiya tuzilishi.

    Strukturani tushuntirishning afzalliklari va kamchiliklari

    Sof, yuqori konsentratsiyali (mm) oqsil namunasini olish rentgen kristallografiyasi uchun ham, NMR uchun ham katta to'siqdir. Yuqori konsentratsiya talab qilinadi, chunki ikkala usul ham bitta molekula tahliliga sezgir emas va signaldan shovqin to'sig'ini engish uchun ma'lum bir oqsilning katta populyatsiyasi talab qilinadi. Shunga o'xshash eslatmada namuna juda bir hil bo'lishi kerak, shuning uchun bir nuqtada proteinni tozalash kerak. Cryo-EM boshqa ikkita usulga qaraganda ancha kam protein talab qiladi, lekin har qanday standart bo'yicha "juda ko'p". Odatda, Cryo -EM kamida 50 va undan ko'p bo'lmagan hajmda 1 mg/ml konsentratsiyali preparatlarni talab qiladi, kristallogenez uchun esa 5-10 mg/ml konsentratsiyasida 500 mul protein kerak. Cryo-Em shuningdek, yaxshi muzlash va tasvir kontrastini ta'minlash uchun oqsilni minimal tuzli buferda tayyorlashni talab qiladi.

    Yordamida rekombinant oqsil ishlab chiqarish E. coli ko'p miqdorda oqsil kerak bo'lganda tanlash usuli hisoblanadi. Bu jarayon qiziqish oqsilining genini (ko'pincha cDNA) olish, uni mos induktiv vektorga bo'lish va vektorni E. coli mezbon va madaniyatni boy muhitda o'stirish. Bakteriyalar xosti o'sish bosqichida ko'payadi, shundan so'ng u qiziqish oqsilini ifoda etadi. Agar hamma narsa yaxshi bo'lsa, oqsil eruvchan va ko'p miqdorda ifodalanadi. Afsuski, bu jarayonni aytish osonroq. Ko'pgina eukaryotik oqsillar prokaryotik xostlarda yaxshi ifodalanmaydi va ko'pincha rekombinant oqsilning munosib hosilini olish uchun bakterial xostni, kodondan foydalanishni, muhitni va hokazolarni optimallashtirish uchun o'zgartirishlar kiritish kerak. Bundan tashqari, oqsillar ko'pincha inklyuziya tanasi sifatida erimaydigan tarzda ifodalanadi va ularni eritish uchun karbamid yoki guanidin gidroxlorid kabi yuqori konsentratsiyali denaturantlarni (2M dan 8M gacha) talab qiladi va keyin ularni qayta tiklash uchun tegishli buferga bosqichma-bosqich dializ qilinadi. Shu bilan bir qatorda, eukaryotik organizmlar S. cerevisiae (achitqi), hasharotlar va sutemizuvchilar hujayra liniyalaridan foydalanish mumkin, ayniqsa tarjimadan keyingi o'zgartirishlar zarur bo'lganda, lekin bu organizmlar uchun hosildorlikning pasayishi va umumiy xarajatlarning oshishi odatiy holdir.

    Protein ishlab chiqarishning qiyinligi NMR uchun barcha oqsillar 15 N va/yoki 13 C yorliqli bo'lishi kerakligi bilan murakkablashadi, chunki faqat bu izotoplar radiochastota uchun zarur bo'lgan energiya o'tishlarini ta'minlaydigan + & frac12 va - & frac12 spin holatlariga ega yadrolarga ega. NMR signali shuni ta'kidlaydiki, 1 H ham & frac12 spin holatiga ega, lekin juda ko'p.

    Protein barqarorligi kristallografiya va NMR uchun ham muammo hisoblanadi. Protein ifoda etilganidan, tozalanganidan va konsentratsiyalanganidan so'ng, u tajribalar davomida tuzilmaviy yaxlitligini saqlab turishi kerak. Kristallografiya uchun bu kristallanish jarayonini o'z ichiga oladi, bu erda oqsil namunasi kristallanishni keltirib chiqaradigan turli xil eritmalarga joylashtiriladi (ko'pincha yuqori konsentratsiyali polietilen glikol). Ko'pincha vudu texnikasi deb ataladigan kristallanish shartlari yuqori o'tkazuvchanlik usulida 96 quduqli skrining plitalari yordamida sinovdan o'tkaziladi va har qanday zarbalar katta hajmdagi eritma yordamida optimallashtiriladi. Kristallanish holati oxir-oqibat topilishi mumkin bo'lsa-da, jarayon bir necha kundan bir yoki ikki yilgacha davom etishi mumkin, bu esa kristallanish jarayonini oqsil kristallograflari uchun tezlikni cheklovchi bosqichga aylantiradi. Bu vaqt mobaynida oqsil eritmada qolishi va yuqori sifatli kristal hosil qilish uchun tuzilishini saqlab turishi kerak.

    Xuddi shunday, NMRning eng ilg'or tajribalarini o'tkazish uchun barqaror, yuqori konsentratsiyali oqsil namunasi talab qilinadi. Buning sababi shundaki, bunday tajribalarning ko'pchiligi bir necha kun va hatto haftalarni talab qiladi, bu vaqt davomida eritmaning bir xilligi sifatli spektrlarni olish uchun kalit hisoblanadi. Agar tajriba davomida oqsil ochilib qolsa yoki eritmadan cho'ksa, natijada paydo bo'lgan kimyoviy o'zgarish hech qanday signalni keltirib chiqarmaydi yoki strukturani/dinamikani aniqlash uchun ishlatib bo'lmaydi.

    Cryo-EM uchun muzlatilgan gidratlangan namunalar bilan ishlash manipulyatsiya uchun ham, tasvirlash uchun ham bir qator qiyinchiliklarni keltirib chiqaradi. Kriyo-EM panjaralarini mikroskopga yuklash uchun ishlatganda, atmosferadagi suv bug'iga ta'sir qilish tezda gridda muzlashning paydo bo'lishiga olib keladi. TEM ostida, panjara yuzasidagi bu muz kristallari elektron nurlarini butunlay to'sib qo'yadigan ulkan toshlar kabi ko'rinadi. Shunday qilib, sovuq ifloslanishni kamaytirish uchun panjaralar iloji boricha suyuq azot ostida saqlanadi. Muz sharoitlari bilan bog'liq muammolar keng tarqalgan&mdashinyetarli darajada tez muzlash olti burchakli muzning shakllanishiga olib keladi, devitrifikatsiya esa namunalar qizdirilganda sodir bo'lib, kubik muz hosil bo'lishiga olib keladi. Har xil darajadagi ifloslanish sodir bo'lishi mumkin va atmosfera bosimida muzlash yuqorida aytib o'tilgan muz kristalining cho'kishiga olib keladi, ustun ichida yoki past vakuum sharoitida ifloslanish yanada nozik artefaktni keltirib chiqaradi.

    Protein kristallografiyasining o'ziga xos xususiyatlaridan biri shundaki, uning hajmi muhim emas. 25 kDa monomerik oqsil yoki 900 kDa multimerik kompleks bilan ishlayaptimi, agar u kristallanib, yuqori aniqlikdagi diffraktsiya naqshini hosil qilsa, uning tuzilishini aniqlash mumkin. Buning sababi shundaki, bir marta kristall shaklda bo'lgan oqsil kamroq yoki kamroq statik konformatsiyada bo'lib, uni rentgen nurlari orqali turli burchaklarda o'tkazgandan so'ng, bitta strukturaviy modelni hosil qilishi mumkin. Cryo-EM bu borada o'xshash. Juda katta tuzilmalarni, shu jumladan ribosoma kabi massiv nukleoprotein komplekslarini Cryo-EM yordamida aniqlash mumkin. NMR haqida ham shunday deyish mumkin emas.

    NMRda oqsil eriydi va shuning uchun doimiy harakatda bo'ladi. Spektral sifatni boshqaradigan eng muhim harakat molekulyar aylanish tezligidir. Taxminan 40 kDa dan ortiq oqsillar uchun yiqilish tezligi sezilarli darajada pasayadi, bu esa ko'ndalang bo'shashish tezligini oshiradi (T2). Asosan, bu kuchsizroq va tez parchalanadigan NMR signaliga olib keladi, bu o'zini eng yuqori kengayish va spektral o'zaro bog'liqlikda namoyon qiladi.

    NMRning asosiy afzalliklaridan biri bu oqsilning kristallanishida, odatda, bostiriladigan, kichik va katta hajmdagi oqsil dinamikasini yozib olish qobiliyatidir. Kristallangan oqsil panjara ichida ma'lum miqdordagi harakatni ko'rsatishi mumkin bo'lsa -da, harakatlar o'zini statik yoki dinamik buzuqlik sifatida namoyon qiladi, ularning birinchisi ma'lum bir mintaqaning ikki xil konformatsiyasiga olib kelishi mumkin, ikkinchisi esa elektron zichligi o'rtacha. Umuman olganda, kristallanish oqsilning tabiiy egiluvchanligi va harakatini cheklashi mumkin. Cryo-EM xuddi shunday cheklovdan aziyat chekadi, chunki namunalar muzlatilgan va harakatsiz. Biroq, kriyo-EM mahalliy tuzilmani suratga olishga qodir, chunki muzlash bir zumda sodir bo'ladi va kristall panjara hosil bo'lishini talab qilmaydi.

    Kristallografiya dinamik strukturani tahlil qilishda sovuqda qolmaydi. Vaqti-vaqti bilan aniqlangan kristallografiya yordamida ba'zi ligand qo'shilganda oqsil tarkibidagi o'zgarishlarni yoki muhit o'zgarishini kuzatish mumkin. Barcha oqsil kristallari yuqori darajada gidratlanganligi sababli, ular ba'zi biokimyoviy reaktsiyalar uchun qoziq vazifasini o'taydilar. Kristal odatda biokimyoviy reaktsiyani boshlash uchun qiziqtiradigan ligandni o'z ichiga olgan eritmada namlanadi, shundan so'ng kristal tezda nur chizig'iga joylashtiriladi va diffraktsiya naqshlari olinadi. Agar kerak bo'lsa, turli xil tarkibiy qidiruv mahsulotlarni olish uchun buni bir necha marta bajarish mumkin. Jarayon ko'p narsalarni to'g'ri yo'lga qo'yishni talab qiladi: namlash jarayonida oqsil buzilib ketmaydi va kristall yorilib ketmasligi kerak va qisqa ta'sir qilish vaqtlarida yuqori sifatli diffraktsiya ma'lumotlarini to'plash uchun yuqori quvvatli sinxrotron talab qilinadi.

    Oxir-oqibat, oqsilli rentgen kristallografiyasi, krio-EM va NMR spektroskopiyasi bir-birini istisno qiladigan usullar emas, boshqasi etishmayotgan joyni osongina tanlash mumkin. NMR dinamikasi tajribalarini tahlil qilishda, masalan, mavjud bo'lgan kristalli tuzilish ma'lumotlaridan yoki NMR strukturaviy ma'lumotlarini bir-biriga qo'shib qo'yish mumkin bo'lgan krio-EM ma'lumotlaridan katta foyda olish mumkin. Xuddi shunday, NMR tuzilishi ma'lumotlari krio-EM yoki kristalli tuzilmani oqsil dinamikasi, bog'lovchi ma'lumot va eritmadagi konformatsion o'zgarishlar haqida qo'shimcha ma'lumot bilan to'ldirish uchun ishlatilishi mumkin.

    Tepaga qaytish

    3.5 Proteoma tahlili

    Proteom - bu organizm yoki tizim tomonidan ishlab chiqarilgan yoki o'zgartirilgan oqsillarning butun majmui. Proteomika tobora ko'payib borayotgan oqsillarni aniqlash imkonini berdi. Bu vaqt va hujayra yoki organizm duch keladigan aniq talablar yoki stresslarga qarab o'zgaradi. Proteomika - bu turli genom loyihalari, shu jumladan "Inson genomlari" loyihasining genetik ma'lumotlaridan katta foyda olgan fanlararo sohadir. U oqsil tarkibi, tuzilishi va faolligining umumiy darajasidan proteomlarni o'rganishni o'z ichiga oladi. Bu funktsional genomikaning muhim tarkibiy qismi.

    Genomika va transkriptomikadan keyin proteomika biologik tizimlarni o'rganishning navbatdagi bosqichidir. Bu genomikaga qaraganda murakkabroq, chunki organizmning genomi ko'proq yoki kamroq doimiydir, proteomalar esa hujayradan hujayraga va vaqti-vaqti bilan farq qiladi. Alohida genlar turli xil hujayra turlarida ifodalanadi, ya'ni hujayrada ishlab chiqariladigan oqsillarning asosiy to'plami ham aniqlanishi kerak.

    Ilgari bu hodisa RNK tahlili bilan baholangan, ammo uning tarkibida protein miqdori bilan bog'liqlik yo'qligi aniqlangan. Ma'lumki, mRNK har doim ham oqsilga aylantirilmaydi va ma'lum miqdordagi mRNK uchun ishlab chiqarilgan oqsil miqdori u transkripsiya qilingan genga va hujayraning hozirgi fiziologik holatiga bog'liq. Proteomika oqsil mavjudligini tasdiqlaydi va mavjud miqdorni to'g'ridan-to'g'ri o'lchash imkonini beradi.

    Hujayra turli vaqtlarda yoki turli sharoitlarda, masalan, rivojlanish, hujayra farqlanishi, hujayra sikli yoki kanserogenez jarayonida turli xil oqsillar to'plamini hosil qilishi mumkin. Yuqorida aytib o'tilganidek, proteomlarning murakkabligi oshadi, aksariyat oqsillar post-translyatsion modifikatsiyaga uchraydi.

    Shuning uchun, agar o'rganish mavzusi cheklangan bo'lsa ham, proteomikani o'rganish juda tez murakkablashishi mumkin. Ko'proq ambitsiyali sharoitlarda, masalan, saratonning ma'lum bir turi uchun biomarker qidirilganda, proteomik olim saraton kasalligiga chalingan omillarni kamaytirish va eksperimental shovqinni hisobga olish uchun bir nechta qon zardobi namunalarini o'rganishni tanlashi mumkin. Bundan tashqari, ko'plab oqsillar fosforillanish kabi posttranslyatsiya o'zgarishlariga uchraydi. Ushbu post-translyatsion modifikatsiyalarning ko'pchiligi oqsil funktsiyasi uchun juda muhimdir. Shunday qilib, proteomning dinamik murakkabligini hisobga olish uchun ba'zida murakkab eksperimental dizaynlar kerak bo'ladi.

    3.6 Adabiyotlar

    Molnar, C. va Gair, J. (2013) antikorlar. Miloddan avvalgi nashr etilgan "Biologiya tushunchalari" bo'limi. Darslik loyihasini ochish. Mavjud: https://opentextbc.ca/biology/chapter/23-3-antibodies/

    Inson atlas loyihasi. (2019) usullari. Mavjud: https://www.proteinatlas.org/learn/method

    Uhlén M va boshqalar, 2015. To'qimalarga asoslangan inson proteomining xaritasi. Fan
    PubMed: 25613900 DOI: 10.1126/fan.1260419


    Affinity xromatografiyasi (AC)

    Affinite xromatografiyasi-bu ko'p bosqichli jarayon (bog'lash, yuvish, elusiya), maqsadli molekulalarning ustunli materialga o'ziga xos bog'lanishi bilan tavsiflanadi. Shuning uchun statsionar fazaning ligandlari maqsadli molekulalarga mos kelishi kerak. Yuvish bosqichida namunaning barcha o'ziga xos bog'lanmagan qismlari chiqariladi. Keyingi tozalash bosqichi maqsadli molekulalarni chiqaradi.


    Natijalar

    UPEC CFT073 va MC4100 dan oqsillarni tayyorlash bo'yicha FliC

    Biz dastlab fizik kesish, filtrlash va ultratsentrifugalash natijasida hosil qilingan butun hujayra lizatlari va flagella bilan boyitilgan oqsil preparatlaridan olingan ekstraktlarda FliC ning hosildorligi va nisbiy tozaligini baholadik. Anti-flagellin antiser yordamida UPEC CFT073 va MC4100 (suyuq muhitda o'stiriladi) dan tayyorlangan butun hujayrali lizatlarning Western blot tahlili CFT073 yoki MC4100 (ishlamaydigan) uchun aniq tasmalar ko'rsatmadi. flhDC) (Barembruch va Xengge, 2007). pMG600 ning joriy etilishi (tarkibida flhDC dan genlar Serratiya) MC4100 ga kirganda, FliC (繀 kDa) uchun tasma paydo bo'ldi, bu shtammda flagella ifodasini tiklashini ko'rsatdi (2A -rasm).

    2-rasm. UPEC CFT073 va MC4100 ning butun hujayrali lizatida FliCni aniqlash E. coli. (A) CFT073 Vt (1-qator), MC4100 (2-qator) va MC4100+p ning butun hujayra lizatidan foydalangan holda FliC uchun Western blotflhDC (3 -qatorli chiziq va#x0007E40 kDa). Hujayra lizatlari bakterial suyuq kulturalardan olingan va H-tipli anti-flagellinli hovuz antiserasi bilan reaksiyaga kirishgan. MC4100+p da flagella haddan tashqari ifodasiflhDC FliC aniqlash natijalari. (B) Kesish, filtrlash va ultratsentrifugalashning fizik usullaridan foydalangan holda flagella uchun boyitilgan oqsil preparatlari yordamida FliC uchun Western blot. Ko'rsatilgan: flagella bilan boyitilgan CFT073 Wt preparatlari (1-yo'nalish 1,0 va 2,5 BCg oqsil, mos ravishda, 繠 kDa tasmalari), MC4100 (3-yo'lakda bandsiz), MC4100+pflhDC (4 tasma va#x0007E40, 繠 kDa), CFT073 va#x00394fliC (5 bandsiz), va MC4100 & # 43pflhDC 0,25% yumshoq agar kulturasidan tayyorlangan butun hujayrali lizat (6 band 繀 kDa). (C) Coomassie Western blot uchun ishlatilgan oqsil namunalarining SDS-PAGE jeli bilan bo'yalgan. M, Marker.

    Flagella uchun fizik usullar bilan boyitilgan oqsilli preparatlarning keyingi tahlili CFT073 (繠 kDa) uchun bandni ko'rsatdi va MC4100da flagella ifodasini shunga o'xshash tarzda qayta tiklashflhDC transda MC4100 p da kutilgan o'lchamdagi FliC diapazoniga qo'shimcha ravishda (繀 kDa)flhDC flagella-boyitish CFT073 (繠 kDa) bilan solishtirganda ekvivalent kattalikdagi tasmani kichik bantlar bilan birga aniqladi (2B-rasm). CFT073 va#x00394 dan olingan flagella uchun boyitilgan oqsil preparatlarida hech qanday tasmalar aniqlanmagan.fliC (2B -rasm).

    0,25% yumshoq agar yordamida tayyorlangan butun hujayra lizatlari flagella ifodasini oshirdi va FliC uchun kuchli tasmani aniqladi, ammo sezilarli protein ifloslantiruvchi moddalarni aniqladi (2B, C-rasmlar). Proteaza inhibitori qo'shilishi, oldingi tadqiqotda kuzatilganidek, proteoliz nuqtai nazaridan ahamiyatsiz ta'sir ko'rsatdi (Lu va boshq., 2013). Tarkibida sharli podshipniklar bo'lgan mikrotsentrifuga naychalaridagi qo'zg'alish jarayoni uning hayotiyligiga aniq ta'sir ko'rsatmadi. E. coli, “pre-” va “post-𠇚gitatsiya madaniyatlarini solishtiradigan teng miqdordagi c.f.u. (o'rtacha qiymatlar ± SEM “pre-” = 2,28 ± 0,1 × 10 8 cfu mL 𢄡 ga nisbatan “post-𠐝x01Dx010.m. 𢄡). Birgalikda, bu ma'lumotlar (i) FliC ifodasi MC4100 tomonidan berilganligini ko'rsatadi flhDC ta'minlangan transda, (ii) flagella-boyitish, asosan, 繠 kDa (CFT073/p) populyatsiyasini hosil qiladi.flhDC) va 繀 kDa (MC4100/pflhDC) va (iii) suyuq kultura yuqori tozaligi tufayli FliC ni boyitish uchun yumshoq agar kulturasidan ustundir, lekin flagellaning kamroq ifodalanishi tufayli (hatto IPTG qoʻshilgan madaniyat sharoitida ham) umumiy hosildorlikni taʼminlaydi. flhDC ifoda CFT073/pflhDC).

    FliCni CFT073 va#x00394 dan tozalash4 va Birgalikda tozalangan oqsillarni aniqlash

    Yuqorida tavsiflangan usullar Coomassie bilan bo'yalgan SDS-PAGE jellari va G'arbiy dog'lar (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) ichida kuzatilgan kichik ifloslantiruvchi chiziqlar bilan solishtirganda, asosiy diapazonning (FliC) densitometrik intensivligi asosida taxminan 85% FliC ning maksimal nisbiy tozaligiga erishdi. FliC immunologik tahlillarga mos bo'lishi uchun biz yuqori darajadagi poklikka erishishga harakat qildik va tashqi oqsillarni ifloslantiruvchi moddalarni minimallashtirishga genetik yondashdik. Bunga erishish uchun biz CFT073Δ deb nomlangan CFT073 ning bir nechta mutant shtammidan foydalandik.4 (Wurpel va boshq., 2014), bu asosiy sirt fimbriyalarini, shu jumladan 1-toifa, F1C va P fimbrialarni kodlovchi genlarda delektsiyalarni o'z ichiga oladi, bu uning hosilasi CFT073Δ bilan birga FliC ekstraktsiyasi uchun ishlatilgan.4ΔfliC keyingi tahlillar uchun tashuvchi nazoratini yaratish.

    CFT073 Δ dan flagella jismoniy chiqarilishi4 SDS-PAGE jellarining densitometrik tahliliga ko'ra FliC ekstraktlarining nisbiy tozaligini 纕% ga oshirdi (3A-rasm). Bu oqsillarni mikroelementlar bilan ifloslanishini aniqlash uchun yuqori sezuvchanlik darajasiga erishish uchun odatda tahlil qilinganidan ko'ra ko'proq miqdorda jellarda oqsillarni tahlil qilish juda muhim edi. Biz qolgan ifloslantiruvchi bantlarni jel bilan tozaladik va oqsillarni mass-spektrometriya (MS) yordamida aniqladik, ularning quyi oqimdagi tahlillarda xost-patogen o'zaro ta'sirini o'zgartirishdagi potentsial ahamiyatini baholash uchun. MS tahlili bu oqsillarni asosiy tashqi membrana oqsillari OmpA va OmpC va sirtda lokalizatsiya qilingan fimbrilin va fimbrial oqsil sifatida aniqladi (4-jadval), bu oqsillar xost-patogen o'zaro ta'sirida muhim rol o'ynaydi, shu jumladan fagotsitlarni tozalash retseptorlari bilan bog'lanadi va asosiy immunogenlar sifatida ishlaydi (Jeannin). va boshqalar, 2005 Liu va boshqalar, 2012). Smit va boshqalar tomonidan tasvirlangan bakterial flagellinni tozalash protokoli bilan solishtirish. (2003) biz oqsilning yuqori rentabelligini va fimbrillin bilan ifloslanishini kuzatdik, lekin bizning protokoldan foydalanib, unchalik katta bo'lmagan molekulyar og'irlikdagi turlarni ko'rdik (3B -rasm). Shuning uchun biz ularni FliCdan ajratishning qo'shimcha usullarini izladik, post-tozalash.

    3 -rasm. Protein profillari fliC-boyitilgan ekstraktlar CFT073 Δ4fim Δfok Δpap1 Δpapa 2) va uning fliC-etishmayotgan lotin. (A) Coomassie CFT073 flagella uchun boyitilgan FliC oqsil preparatlarining SDS-PAGE jeli (5 va x003BCg) bilan bo'yalgan./pflhDC (1), CFT073 va#x00394fliC/pflhDC (2), CFT073Δ4/pflhDC (3) va CFT073 va#x003944ΔfliC/pflhDC (4) a-e yorlig'i bilan belgilangan chiziqlar jel ekstrakti va keyinchalik oqsillarni aniqlash uchun massa spektrofotometriyasi bilan tahlil qilindi va 3-jadvalda keltirilgan. (B) Coomassie (Smit va boshq., 2003) (1) tomonidan ta'riflangan bakterial flagellinni tozalash protokoli yordamida tayyorlangan protein namunalarining SDS-PAGE jelini (10 μg) bo'yadi. Nisbatan fimbrillin va yuqori molekulyar og'irlikdagi turlarning farqlari jelda ko'rsatilgan. M, Marker.

    4 -jadval. CFT073Δ dan FliC bilan ajratilgan birgalikda tozalangan oqsillarning identifikatorlari4 va uning fliC-kesish, filtrlash va ultratsentrifugalashning fizik jarayonlaridan foydalangan holda nuqsonli hosila.

    FPLC va endotoksinni olib tashlash yordamida FliCni bir jinsliligidan keyingi tozalash

    Yuqori darajada toza FliC hosil qilish uchun, kesish, filtrlash va ultratsentrifugalashning fizik jarayonlari yordamida yuqoridagi kabi tozalangan oqsil ekstraktlari keyinchalik Superdex 200 10/300 GL ustuni bo'lgan ÄKTA sof oqsillarni tozalash tizimi yordamida o'lchamsiz xromatografiya yordamida ajratildi. Fraktsiyalar ultrabinafsha nurlanish yutish usuli bilan 215 va 280 nmda elusiya paytida tahlil qilindi, yig'ildi va tarkibida oqsil bo'lgan fraktsiyalar Ultra Spin ustunlari yordamida konsentratsiya qilindi va SDS-PAGE tomonidan tahlil qilindi. Shakl 4Ada ko'rsatilganidek, FliC 13 -fraktsiyada bitta tepalik bilan elute qilingan. 280 nm standart ultrabinafsha nurlanish yutilish sozlamalari (elyusiya qilingan fraksiyalardagi oqsillarni kuzatish uchun ishlatiladi) oqsilda triptofan (va bir nechta tirozin qoldiqlari) yo'qligi sababli FliC ni aniqlamadi, bu FliC ni kuzatish uchun alternativ 215 nm to'lqin uzunligini qo'llashni talab qildi.

    4-rasm. CFT073 Δ dan FliC bilan boyitilgan ekstrakti oqsil profil4fim Δfok Δpapa 1 Δpap2). (A) CFT073 va#x00394 ekstraktidan FliC xromatogrammasi4. (B) CFT073 dan olingan 13-qismdagi SDS-PAGE protein jeli (5 μg)4/pflhDC (1) va CFT073 Δ4ΔfliC/pflhDC (2) oqsil konsentratsiyasini santrifüj filtrlar yordamida kuzatib borish. M, Marker.

    Muhimi shundaki, ushbu tajribalar FLPC CFT073Δ dan barcha begona oqsillarni ifloslantiruvchi moddalarni to'liq olib tashlashga erishganligini ko'rsatdi.4 FliC ekstraktlari (4B-rasm). Tozalashdan keyingi jarayon FliC preparatlarini endotoksinlarni olib tashlash ustunlariga qoʻllash orqali yakunlandi, buning natijasida oxirgi preparatlardagi endotoksinning oʻrtacha darajasi 0,005 ± 0,002 EI.μg.𢄡, avvalgi xabarlarda bildirilgan darajadan ancha past bo'ldi. tozalangan FliC (maksimal 0,125 EI.μg 𢄡 Braga va boshq., 2008, 0,025 EI.𢄡 Metcalfe va boshq., 2010) va FliA (0.ƼU) ning immun stimulyatsion tadqiqotlari. 𢄡 Schulke va boshqalar, 2010). Endotoksinni olib tashlashning ushbu bosqichini bajarmasdan, FliC preparatlari muntazam ravishda Evropa Ittifoqi 1dan yuqori ifloslantiruvchi endotoksin kontsentratsiyasini namoyish etdi. Birgalikda, bu ma'lumotlar fizik ekstraktsiya usullari bo'yicha topilmalarimiz bilan birgalikda FLPC asosidagi post-tozalash va endotoksinni yo'q qilish, denaturatsiyalanmagan UPEC FliC-ni bir jinsliligidan keyingi tozalash uchun mukammal usul bo'lib, quyi immunologik tahlillar uchun juda mos keladi.

    FliC homopolimerlarining issiqlik barqarorligining tavsifi

    Flagellar filament 11 ta protofilamentdan iborat bo'lib, ularning har biri subunit hidrofobik o'zaro ta'sirlar orqali homopolimerlar sifatida stabillashgan FliC monomerlaridan iborat (Yonekura va boshq., 2003). Turlar orasidagi flagella filamentlarining barqarorligining o'zgarishi (Yoon va Mekalanos, 2008) bizni CFT073 FliC gomopolimerlarining issiqlik barqarorligini tavsiflashga undadi va FliC monomerlarini hosil qilish va oqsil denatüratsiyasini minimallashtirish, shuning uchun tozalangan oqsillar xost-patogen uchun ideal tarzda mos keladi. o'zaro ta'sir tahlillari. Harorat gradiyentlari bilan o'tkazilgan tajribalar shuni ko'rsatdiki, 10 daqiqa davomida 60 va#x000B0C bilan ishlov berish FliC monomerlarini 90% ga yaqin samaradorlikda ishlab chiqaradi (5 -rasm). 60 ° C dan yuqori haroratlar monomerizatsiya samaradorligini biroz oshirishga olib keldi, 50 ° C dan past haroratlarda esa minimal monomerizatsiya. Shunday qilib, 60 ଌ FliC monomerlarini samarali ishlab chiqarishga imkon beradigan, lekin issiqlik denaturatsiyasining ta'sirini cheklash uchun maqbul deb tanlandi. Keyin biz monomerizatsiyalangan FliCning bu issiqlik bilan ishlov berishdan so'ng o'z-o'zini polimerizatsiya qilish tendentsiyasini o'rganib chiqdik, flagellar filamentlari xona haroratida (RT), 60 ଌ yoki 90 ଌ da inkubatsiya qilindi va oqsillar 4 va 4000 ° S haroratda saqlandi. 2, 24 yoki 48 soat davomida 37ºC. Shu tarzda ishlangan oqsillarning mahalliy gel-tahlillari FliC monomerlarining filamanlarga qayta polimerizatsiyasini monomerlarni inkubatsiyalash va 4 ° C haroratda saqlashdan keyin aniqlanmadi. Bundan farqli o'laroq, RT yoki 37 va#x000B0C da 24 soat yoki undan ko'proq saqlanadigan FliC ba'zi polimerizatsiyani ko'rsatdi (6-rasm). Biz bu ma'lumotlardan xulosa qilamizki, UPEC FliC monomerlari monomerlar sifatida nisbatan barqarordir, ular polimerizatsiyadan keyin kamida 2 soat davomida 60 va#x000B0C da 10 minut davomida, lekin yuqori haroratlarda va/yoki uzoq vaqt davomida monomerlarning inkubatsiyasi ma'lum darajaga olib keladi. o'z-o'zini qayta polimerizatsiya qilish.

    5 -rasm. Tozalangan FliC ning issiqlik ta'sirida momerizatsiyasi. FliCning polimerik filamentlardan FliC monomerlariga bo'linishini ko'rsatuvchi mahalliy PAGE jeli (A) va har bir sinovdan o'tgan haroratda monomerlarning nisbiy densitometrik miqdorini aniqlash (B).

    6 -rasm. FliC monomerlarining barqarorligi. Taxminan 5 º003BCg FliC (10ºBCl), mahalliy gel buferida suyultirilgan xona haroratida (RT), 60ºC yoki 90ºC da inkubatsiya qilindi, oqsillar 4ºC, RT03ºC va RT 030ºC da saqlanadi. 2 soat (A), 24 soat (B) va 48 soat (C) va keyinchalik mahalliy jellarda hal qilinadi. Tasvirlarda inkubatsiya qilingan va 4°C da saqlangan FliC flagella filamentlarida sezilarli qayta polimerlanish kuzatilmagan. Bundan farqli o'laroq, RT yoki 37 ° C da 24 soat yoki undan ko'proq vaqt davomida saqlangan FliC tasvirlarda ikkita asosiy tasma (bitta tarmoqli o'rniga) ko'rinadigan ba'zi qayta polimerizatsiyani ko'rsatdi. (B) va (C).

    Makrofaglarning yuqori darajada tozalangan FliC ga sitokin javobi

    Bir xillikka tozalangan FliCning immunologik faolligini baholash uchun biz sof FliCni makrofaglarni stimulyatsiya qilish tahliliga qo'lladik. in vitro. J774A.1 sichqonchani makrofaglarining 5 soat davomida 1 μg FliC ta'sirida bo'lishi TNF-α, IL-1 β, IL-6, KC, IL-12 (p40) va IL- ishlab chiqarishning sezilarli darajada oshishiga olib keldi. 12(p70) (7-rasm), biz ushbu tajribalar uchun mos tashuvchi boshqaruvini yaratdik. fliC CFT073 va#x00394 lotinlari4 (GU2642), ular yuqoridagi FliC preparatiga o'xshash tarzda qayta ishlangan. FliC bilan stimulyatsiya qilish bilan solishtirganda, makrofaglar madaniyatida bu tashuvchilar nazorati (ya'ni GU2642 dan olingan ekstraktlar) yoki faqat madaniy muhitga ta'sir ko'rsatadigan sitokinlarning birorta ham muhim darajasi bo'lmagan (7 -rasm). Biz ilgari flagella bilan bog'lanmagan G-CSF va GM-CSF (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) kabi boshqa sitokinlarning sezilarli darajasini kuzatmadik, shuningdek, ilgari bog'langan IFN-γ ning sezilarli darajalarini aniqlamadik. flagella uchun uyali javoblar bilan (Wyant va boshq., 1999). Endotoksinni olib tashlashning makrofag reaktsiyalariga ta'sirini o'rganish, endotoksinni olib tashlash uchun davolangan FliC bilan solishtirganda, endotoksinni olib tashlash uchun davolanmagan (“pre-”) tozalangan FliC bilan stimulyatsiya qilingan madaniyatlarda bir nechta sitokinlarning yuqori darajasini ko'rsatdi. “post-”) (8-rasm). Har xil miqdordagi FliCga makrofaglarning javoblarini taqqoslash shuni ko'rsatdiki, FliC & x0003C1 μg miqdori bir nechta sitokinlarni, masalan, 0,05 va#x003BCg FliC tomonidan nazorat qilinadigan madaniyatlarga nisbatan sezilarli darajada TNF-α ishlab chiqarishga olib kelgan. faqat tashuvchi bilan davolash qilingan (8-rasm). Odamning U937 monotsitlari va 5637 epiteliy hujayralaridan foydalangan holda o'tkazilgan alohida tahlillarda biz TNF-α, IL-1β va IL-6 uchun o'xshash muhim javoblarni kuzatdik, ammo IL-8 yoki IL-12(p70) uchun muhim javoblar yo'q (ma'lumotlar). ko'rsatilmagan). Ushbu topilmalar shuni ko'rsatadiki, ushbu tadqiqotda kuzatilgan makrofaglarning proinflamatuar sitokin reaktsiyalari to'g'ridan -to'g'ri FliCga tegishli va flagella immunitetini stimulyatsiya qilish xususiyatlari haqidagi oldingi hisobotlarga mos keladi.

    7 -rasm. Makrofaglarning UPEC CFT073 dan bir hillikka tozalangan FliCga sitokinli javobi Δ4. J774A.1 makrofaglari 5 soat davomida 1 μg FliC bilan rag'batlantirildi va TNF-α, IL-1 β, IL-6, KC (insonning funktsional ekvivalenti sifatida tanlangan) supernatantlardan foydalanildi. IL-8), IL-12 (p40) va IL-12 (p70). FliC ushbu sitokinlarning yuqori konsentratsiyasini Carrier (GU2642 dan bir xil tozalash protseduralari yordamida tayyorlangan) yoki faqat Media nazorati bilan solishtirganda yuqori konsentratsiyasini keltirib chiqardi.

    8 -rasm. Makrofaglarning FliCga sitokinli javobi endotoksinni oldindan va keyin olib tashlash uchun belgilangan protokol bosqichlariga tozalanadi. J774A.1 makrofaglari endotoksinni olib tashlash uchun ishlov berilmagan (“pre-“) va endotoksinni olib tashlash uchun (“post-“) uchun 0,05-1 μg FliC bilan rag'batlantirildi. va supernatantlar TNF-α va IL-6 darajasini o'lchash uchun ishlatilgan. *P < 0,05 ****P < 0.0001.


    Namuna konsentratsiyasi

    Namuna hajmini minimallashtirish va o'lchamlarini tez, yuqori aniqlikda ajratish uchun jel filtratsiyasidan oldin namunani konsentratsiyalash afzal bo'lishi mumkin. HiTrap ustunlari namuna konsentratsiyasi uchun qulay, ishlatishga tayyor echimni taklif qiladi. 7-jadvalda Sepharose HP muhiti bilan oldindan qadoqlangan HiTrap ustunlari yordamida juda suyultirilgan boshlang'ich materialdan oqsillarni konsentratsiyalashda erishilgan yuqori konsentratsiyali omillarga misollar keltirilgan. Shunga o'xshash natijalarga Sefarose Fast Flow yoki Sepharose XL media bilan oldindan qadoqlangan HiTrap ustunlari yordamida erishish mumkin.


    Qo'shimcha fayllar

    Qonni tez ajratish va gematokrit va sarum analizatorlarining miqdorini aniqlash uchun laboratoriya-chip

    Agar siz ushbu maqolaning muallifi bo'lmasangiz va undan materialni RSC bo'lmagan uchinchi tomon nashrida ko'chirmoqchi bo'lsangiz, mualliflik huquqini rasmiylashtirish markazidan rasmiy ravishda ruxsat so'rashingiz kerak. Tafsilotlar uchun Mualliflik huquqini rasmiylashtirish markazi sahifamizdan foydalanish bo'yicha ko'rsatmalarimizga o'ting.

    RSC nashrlariga (jurnal maqolalari, kitoblari yoki kitob bo'limlari) hissa qo'shadigan mualliflar ushbu maqoladagi materiallarni ko'paytirish uchun rasman ruxsat so'rashlari shart emas, agar takrorlangan material bilan to'g'ri tan olingan bo'lsa.

    Qayta ishlab chiqarilgan material quyidagicha ko'rsatilishi kerak:

    • NJC materiallarini qayta ishlab chiqarish uchun:
      Ref.dan ko'chirilgan. XX Milliy de la Recherche Scientifique markazi (CNRS) va Qirollik kimyo jamiyati ruxsati bilan.
    • PCCP dan materialni qayta ishlab chiqarish uchun:
      Ref.dan ko'chirilgan. PCCP egalik jamiyatlarining ruxsati bilan XX.
    • PPS materiallarini qayta ishlab chiqarish uchun:
      Ref.dan ko'chirilgan. XX Evropa Fotobiologiya Jamiyati, Evropa Fotokimyo Assotsiatsiyasi va Qirollik Kimyo Jamiyatining ruxsati bilan.
    • Boshqa barcha RSC jurnallari va kitoblaridan materiallarni ko'paytirish uchun:
      Ref.dan ko'chirilgan. XX Kimyo Qirollik Jamiyatining ruxsati bilan.

    Agar material asl RSC nashridan ko'chirilgan o'rniga moslashtirilgan bo'lsa, "Reproduced from" ni "Adapted from" bilan almashtirish mumkin.

    Barcha holatlarda Ref. XX - adabiyotlar ro'yxatidagi XX -ma'lumotnoma.

    Agar siz ushbu maqolaning muallifi bo'lsangiz, bu maqolada tasvirlangan rasmlar, diagrammalar va boshqalarni takrorlash uchun uchinchi tomon nashrlarida yoki tezis yoki dissertatsiyada takroriy material bilan to'g'ri e'tirof etish sharti bilan rasmiy ravishda ruxsat so'rashingiz shart emas.

    Qayta ishlab chiqarilgan material quyidagicha ko'rsatilishi kerak:

    • NJC materiallarini qayta ishlab chiqarish uchun:
      [Asl iqtibos] - Milliy de la Recherche Scientifique markazi (CNRS) va RSC nomidan Qirollik Kimyo Jamiyati (RSC) ruxsati bilan ko'chirilgan
    • PCCP dan materialni qayta ishlab chiqarish uchun:
      [Asl iqtibos] - PCCP egalari jamiyatlari ruxsati bilan qayta ishlab chiqarilgan
    • PPS materiallarini qayta ishlab chiqarish uchun:
      [Asl iqtibos] - Evropa fotobiologiya jamiyati, Evropa fotokimyo assotsiatsiyasi va RSC nomidan Qirollik kimyo jamiyati (RSC) ruxsati bilan takrorlangan.
    • Boshqa barcha RSC jurnallaridan materiallarni ko'paytirish uchun:
      [Asl iqtibos] - Qirollik kimyo jamiyatining ruxsati bilan takrorlangan

    Agar siz ushbu maqolaning muallifi bo'lsangiz, siz hali ham butun maqolani uchinchi tomon nashrida ko'paytirish uchun ruxsat olishingiz kerak, bundan tashqari, dissertatsiya yoki dissertatsiyada to'liq maqolani takrorlash bundan mustasno.

    Turli litsenziyalarga ega RSC maqolalaridan materiallarni ko'paytirish haqida ma'lumot bizning Ruxsat so'rovlari sahifamizda mavjud.


    Usullari

    Tadqiqotda, Daniyaning Kopengagen universiteti, Veterinariya klinikasi va hayvonotshunoslik kafedrasi diagnostik tahlilidan so'ng, qolgan mijozlarga tegishli bo'lgan otlarning individual namunalari asosida o'tkazilgan tadqiqot o'tkazildi. Namunalarni ushbu tadqiqotga kiritish Daniya, Kopengagen universiteti, Veterinariya klinikasi va hayvonot fanlari kafedrasining mahalliy axloqiy qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. Sarum hovuzidagi SAA kontsentratsiyasi bizning guruhimiz a'zolari tomonidan otlarning SAA diagnostik o'lchovlari uchun ilgari tasdiqlangan savdo turbidimetrik immunoassay yordamida 1600 mg/l ga o'lchandi. Ellik mililitrli zardob hovuzini muzlatish rejimida 𠄴 va x000b0C dan 10 mbar xona haroratiga qadar quritdilar. Analitik va tayyorgarlik jarayonlarining umumiy ko'rinishi   1 -rasmda keltirilgan. SAA ning mavjudligi va tarkibi sarum va preparatlarda IEF, elektroblotlash (Amersham Pharmacia Biotech) va anti-SAA antikorlari bilan immuno-bo'yash (Tri-delta Development Ltd), ilgari bizning guruhimiz tomonidan amalga oshirilgan SAA bo'yicha bir nechta tadqiqotlarda aniqlangan. 6,30,31].

    Tadqiqotga kiritilgan protseduralarning umumiy ko'rinishi. Qo'llaniladigan usullar (o'ralgan) va olingan mahsulotlar Ot zardobidagi A (SAA) zardobini tozalashga urinishda SAA tarkibi va aralashmalari (qutilarda ko'rsatilgan) uchun tahlil qilingan.SAA ning izoformalari izoelektrik fokuslash, elektroblotlash va immunokoin yordamida supernatantlar, fraktsiyalar va cho'kmalarda aniqlandi. Aniqlangan SAA ning tozaligi natriy dodesil sulfat poliakril amidli gel elektroforezi (SDS-PAGE) yordamida baholandi, so'ngra sarum oqsillarini kumush nitrat bilan bo'yashdi. SFE: CO bilan superkritik suyuqlikni olish2. FPLC-SEC: Tez polimerli suyuq xromatografiya o'lchami-eksklyuziv xromatografiya. IEF: Izoelektrik fokuslash.

    Muzlatilgan quritilgan sarum 70% 2-propanol, 8 M karbamid va Milli-Q suvida, har bir millilitrli erituvchiga 10 mg muzlatilgan quritilgan sarum konsentratsiyasida to'xtatildi. Supernatantlar eritilgan SAA izoformlari borligi uchun tahlil qilindi.

    Superkritik suyuqlikni ajratish (SFE) Speed ​​SFE tizimida muzlatilgan quritilgan 600 mg zardob yordamida amalga oshirildi. Ekstraksiya 4 L CO oqimi bilan 50 mPa da amalga oshirildi2 daqiqada 40 va#x000b0C da 30 daqiqa. Ekstraktlar shisha flakonlarda to'plangan va ekstraktsiya modifikator sifatida 96% etanol (1,0 ml / min) yordamida takrorlangan. Ekstrakt va qoldiqlar havoda quritilgan, 8 M karbamidda suyultirilgan va SAA borligi uchun tahlil qilingan.

    SEC Superdex � 10/300 GL ustuni (GE Healthcare) va 20 mM natriy dihidrofosfat va 50 mM natriy xlorid, pH 6,9 bo'lgan bufer yordamida tez polimer suyuq xromatografiyasi (FPLC-SEC) yordamida amalga oshirildi. Tiroglobulin (660 kDa), gammaglobin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), miyoglobin (17 kDa) va siyanokobalamin (1,35 kDa) (Bio-Rad) ni o'z ichiga olgan jel filtrlash standarti molekulyar qiymatlarni baholash uchun ishlatilgan. har xil FPLC fraktsiyalarining og'irligi. Milli-Q suvda (yuqorida tavsiflangan) muzlatilgan quritilgan sarumning suspenziyasi natijasida hosil bo'lgan filtrlangan supernatantning ikki yuz mikroliti ustunga yuborildi va 1,5 mPa bosim ostida 1 ml / min oqimda ajratildi. Ot SAA ning molekulyar og'irligi Phast Gel System (Amersham Pharmacia Biotech) dagi natriy dodesil sulfat va#x02013 poliakrilamidli gel elektroforezi (Amersham Pharmacia Biotech), so'ng elektroblotlash va immunostayn yordamida yuqorida tasdiqlangan. Molekulyar og'irlik markerini (Bio Rad) o'chirishdan oldin ajratib, silvernitrat bilan bo'yalgan (Pharmacia LKB Biotechnology) [32] va standart sifatida ishlatilgan.

    Tayyor IEF Hoefer IsoPrime IEF Purification Unit, (Amersham Pharmacia Biotech) da amalga oshirildi [33,34]. PH 5, 6, 7, 7.5, 8, 8.5 va 9 bo'lgan 7 ta tamponlangan polimembranlar akrilamidobuffers (Fluka BioChemika va GE Healthcare Bioscience) bilan 30% akrilamid/bis-akrilamid (Sigma Aldrich), tetrametiletilenendiamin ( Pharmacia Biothech) va 40% ammoniy persulfat (Bio-Rad). Whatman shisha mikrofiber filtrlari GF/D 47 mm membranalar bilan qoplangan. Kameralar ishlab chiqaruvchining tavsiyalariga binoan Milli-Q suvi bilan to'ldirilgan va 8 M karbamidda muzlatilgan quritilgan zardobni to'xtatilishi natijasida hosil bo'lgan 5 ml supernatant (yuqorida tasvirlangan) 2-ajratish kamerasiga (pH 5 bo'lgan jellar orasiga) surtilgan. va 6). Ajratish 4 Vt doimiy quvvatda 24 soat davomida amalga oshirildi. Preparatlar havoda quritilgan va SAA aniqlashdan oldin 8 M karbamidda eritilgan. Ko'rinadigan cho'kmalar xona haroratida bir kechada 8 M karbamidda eriydi va erigan moddada SAA borligi tekshirildi.

    Supernatantlar, fraktsiyalar va cho'kma tarkibidagi sarum oqsillari preparatlarning tozaligini baholash uchun Phast Gel System (Amersham Pharmacia Biotech) dagi SDS-PAGEdan so'ng silvernitrat [32] bilan bo'yalgan va standart sifatida molekulyar og'irlik markeridan foydalanilgan (Bio Rad).


    Sigir suti proteoz-peptonining hidrofobik fraktsiyasini tez oqsilli suyuq xromatografiya bilan tozalash va ikki o'lchovli elektroforez bilan tavsiflash.

    Sigir suti Proteoz-peptonning gidrofobik qismi tez oqsilli suyuq xromatografiya bilan hidrofob ta'sir o'tkazish yo'li bilan tayyorlanadi. Bu usul yuqori tezlik, oddiy yaxshi takrorlanuvchanlik va kamroq denatürasyon kabi bir qancha afzalliklarga ega. Proteoz-pepton NaH 2 PO 4, pH 6 · 8 ning 1 M-0 M ion kuchi gradienti bilan TSK-Fenil-5PW ustunidan 56 daqiqa davomida 6 ml / min oqim tezligidan foydalangan holda elutsiya qilindi. AOK qilingan protein miqdori 62·5 mg ni tashkil etdi, ammo uni 100 mg gacha oshirish mumkin. Elitlanish tartibi b -CN -4P & lt BSA (umumiy N ning 1 · 6%) & lt b -CN -5P & lt b -CN -1P edi. Hidrofobik fraktsiya gradient oxirida toza suvda olingan (jami N ning 17 · 3%). Ikki o'lchovli elektroforez orqali proteoz-pepton kartografiyasiga erishildi. Bu hidrofobik fraktsiya M r 30000–28000, 19000 va 11000 ning uchta asosiy zonasini ifodalaydi, ular mos ravishda 4 · 9 va 6 · 1 izoelektrik nuqtalar (IP) o'rtasida taqsimlangan 13, 4 va 2 ta asosiy nuqtalardan tashkil topgan. Bu dog'lar glikoproteinlarga to'g'ri keldi. · 7, 5 · 0 va 5 · 1 IP M 18000 ga ko'chib o'tdi, b -CN -1P 5 · 1 va 5 · 3 IP ikkita nuqtada M r 9000 sifatida aniqlandi.


    Muallif haqida ma'lumot

    Aloqalar

    Patologiya bo'limi, Albert Eynshteyn tibbiyot kolleji, Nyu -York, AQSh

    Maya Tanase, Valerio Zolla, Kristina C Klement, Franchesko Borgi, Aleksandra M Urbanska va Laura Santambrogio

    Italiya, Bolonya universiteti, kimyo bo'limi

    Mayya Tanase, Francesco Borghi, Barbara Roda, Andrea Zattoni va Pyerluiji Reschiglian

    Rivojlanish molekulyar biologiyasi kafedrasi, Albert Eynshteyn tibbiyot kolleji, Nyu-York, AQSh


    Videoni tomosha qiling: Oqsillar biosintezi Plastik Almashinuv (Avgust 2022).