Ma `lumot

Tasodifiy DNK ketma-ketligini kesuvchi cheklov fermenti ehtimoli haqidagi masala

Tasodifiy DNK ketma-ketligini kesuvchi cheklov fermenti ehtimoli haqidagi masala


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Menimcha, bu erda so'rash ahmoqona savol. Men bu saytga kelganimda, faqat hodisaning tafsilotlarini tushuntirib beradigan savollar ko'rdim va birinchi navbatda fikr yuritildi. Men bu erga matematikani olib kelaman !!!

Birinchidan, men boshlang'ichman.

Ikkinchidan, men ba'zi muammolarni aytib o'tmoqchiman ...

  1. Genomik DNK AIU I, to'rtta tayanch juft kesuvchi bo'lgan cheklovchi ferment bilan hazm qilinadi. Genomdagi asoslarning tasodifiy taqsimlanishini nazarda tutgan holda, u DNKni kesish chastotasi qanday?

  2. Eco RI va Rsa I cheklash endonukleazlari bo'linish uchun mos ravishda 6 bp va 4 bp ketma-ketlikni talab qiladi. 10 kb DNK fragmentida bu fermentlar uchun qancha bo'linish joylari mavjud?

Bu savollarni o'qituvchim ba'zi ehtimollik natijalari yoki qoidalaridan foydalangan holda hal qildi. Buni shu yerda eslatib o'tmoqchiman... [siz allaqachon bilasiz... !!! ;-)]

(1/4)^n *10 000 yoki oddiygina (1/4)^n. N = qo'yib, ferment bilan kesilgan asosiy juftlik soni.

Men (1/4)^n yordamida genomda bazalarning tasodifiy taqsimlanishini hisobga olgan holda ferment DNKni kesish chastotasini olaman va men 10 kb DNK fragmentida Eko RI va Rsa I uchun bo'linish joylari mavjudligini bilaman.

Lekin nega bunday qilaman? Aytmoqchimanki, nima uchun bu formula? Qanday paydo bo'lganini qanday tushunish mumkin? Menga buni tushuntirib bera olasizmi?

Iltimos, shu kabi tushunchalar va sonli muammolarni o'z ichiga oladigan yaxshi kitoblarni taklif qiling, shunda men ular ustida ishlay olaman ... [Iltimos, manbaingizni ayting]. Rahmat.


EcoRI 5'-GAATTC-3' heksamerini taniydi, bog'laydi va ajratadi. To'liq randomizatsiyalangan DNK ketma -ketligida, 25 % A, 25 % C, 25 % G va 25 % T bilan, biz tasodifiy ravishda GAATTC ketma -ketligini kashf etamiz, har 4096 tayanch juftlikdan bir marta. EcoRI fragmentlarining haqiqiy taqsimoti (har bir uchida bo'lak bo'lgan qism EcoRI sayt) bizning tasodifiy genomimizda o'zgaradi va normal taqsimot yoki egri chiziq hosil qiladi, ba'zi qismlari uzunroq va ba'zilari qisqaroq. O'rtacha qiymat 4096 bo'lishi kerak.

4,096 bp uchun 1 ta saytni kutish haqiqatan ham (1/4)^6 ga teng.

1/4 = 25 %

6 = tanib olish joyidagi qo'shni tayanch juftliklari soni.

Bunday modelda shuni yodda tutish kerakki, ketma-ketlikda bitta bazaning paydo bo'lish ehtimoli ushbu bazadan oldingi ketma-ketliklarga va undan keyingi ketma-ketliklarga mutlaqo bog'liq emas. Boshqacha qilib aytganda, har bir pozitsiya uchun bazaga ega bo'lish ehtimoli EcoRI sayt 25% yoki 4 dan 1 = 1/4.

75% vaqt, keyingi bazasi bir hissa bo'lmaydi EcoRI sayt (va vaqtning to'rtdan bir qismi).

Keling, 10 kb hajmdagi fragmentingizdan boshlaylik va bir uchidan ikkinchisiga o'tamiz va har safar "G" paydo bo'lganda belgilaymiz. Nazariy jihatdan bularning barchasi boshlanishi bo'lishi mumkin EcoRI saytlar, to'g'rimi? Taxminan 2500 ta bunday "G" bo'ladi. Endi bizning namunamizga mos kelish uchun bizga ikkinchi pozitsiyada "A" kerak, shuning uchun "GA" dinukleotidini o'z ichiga olgan saytlarni belgilaylik, ularning 2500 x 0.25 = 625 tasi bo'ladi. Bizga kerak bo'lgan keyingi o'yin - bu 3 -pozitsiya, boshqa "A", shuning uchun ham xuddi shunday GA dinukleotidlarining pozitsiyalarini ko'rib chiqamiz va keyingi pozitsiyada "A" ga ega bo'lganlarni belgilaymiz. Bu taxminan 625 x 0,25 yoki taxminan 156 'GAA 10 kb fragment bo'ylab tasodifiy taqsimlanadi.

Agar biz davom ettirsak, biz "G" saytlarining ko'pini filtrlaymiz, shunda biz o'rtacha ro'yxatda bor.

GAAT bilan 39 ta sayt

GAATT bilan 10 ta sayt

GAATTC bilan 2 ta sayt

Agar menga ishonmasangiz, ketma-ketlikni tanlang va o'zingiz sinab ko'ring.

10,000/4,096 ~ 2.5


Savol: 1. Ketma-ketlikdagi har qanday asosning sitozin bo'lish ehtimoli qanday, C? __________________ Siz inson genomida adeninni necha marta topasiz deb o'ylaysiz? ___________________ 2. Maxsus ikki asosli ketma-ketlikni topish ehtimoli qanday? ____________________ Inson genomida bu ketma-ketlikni necha marta topishni kutasiz? ______________.

4. Inson genomida ma'lum 20 ta baz juftlik ketma -ketligini necha marta topasiz?

5. X uzunlikdagi DNK fragmenti ichida n uzunlikdagi ketma -ketlikning bashorat qilinishini hisoblash uchun to'liq tenglama yozing.

6. Matematik dalillardan foydalanib, nima uchun CRISPR-Cas9 gen kesish texnologiyasi, 20 ta asosiy juftlikdan iborat maqsadli ketma-ketlikni ishlatadi, klassik cheklash fermentlariga qaraganda aniqroq ekanligini tushuntiring.

7.Yozing uch CRISPR-Cas9 texnologiyasi gen terapiyasi va/yoki tadqiqot uchun boshqa genlarni kesuvchi asboblarga qaraganda nima uchun foydali bo'lishi mumkinligi haqida sizda turli fikrlar.

8. Aslida, inson genomining DNK ketma-ketligi tasodifiy emas. Ba'zi ketma-ketliklar, jumladan, juda katta ketma-ketliklar, inson genomida ko'p marta takrorlanadi. Yozish ikkita fikr Sizda bu haqiqat odamlarda CRISPR gen-tahrir qilish texnologiyasidan foydalanishni qanday murakkablashtirishi mumkin.


Stenli N. Koen: Molekulyar biologiyani o'zgartirish

Stenli Koen: "Tezroq o'sib keting, kichkintoylar", - deb eslaydi Stenli Koen, o'z tajribalarini natijalarini ko'rishni juda xohlaganligi uchun, hazillashib, bakteriyalaridan yolvorganini. 1973 yil boshida, olimlar DNKni Stenford tibbiyot maktabidagi Koen laboratoriyasi va Kaliforniya universiteti, San -Frantsiskodagi Gerbert Boyer guruhi o'rtasida oldinga va orqaga tashlagan paytlari, juda og'ir vaqt edi.

Koen laboratoriyada
[Xose Merkadoning izni bilan, Stenford yangiliklar xizmati]

Shifokor sifatida o'qigan Koen o'z tadqiqotlarini infektsiyalarga qiziqish bilan boshladi. 1928 yilda penitsillin va boshqa antibiotiklarning kashf qilinishi yuqumli kasalliklarning tugashidan xabar berdi. "Bu unday emas edi", deydi Koen. "Sababi shundaki, bakteriyalar antibiotiklarga qarshilik ko'rsatdi." Bundan tashqari, bakteriyalar bu qarshilikni o'zaro almashishi mumkin, ba'zida bir vaqtning o'zida bir nechta dorilarga qarshilik ko'rsatishi mumkin.

Bu qarshilik olimlar DNK bakteriyasining bir bo'lagi o'zaro o'tishi mumkin bo'lgan "R-omil" deb nomlangan narsada amalga oshirildi. Bakteriyalar genlarining ko'p qismini o'z ichiga olgan bitta katta xromosomaga ega. Ammo ular genlarni plazmidlar deb ataladigan DNKning kichikroq aylana bo'laklarida ham saqlashi mumkin. R-omillar bu plazmidlarda harakat qiladi. O'sha paytda plazmidlar ustida faqat bir nechta laboratoriya ishlagan va 1968 yilda Koen R-omil qarshilik genlari qanday tartibga solingan, nazorat qilingan va olinganligini tushunishga kirishgan.

Birinchidan, uning laboratoriyasidagi tadqiqotchilar R faktorli plazmidlarni o'z atrofida harakatlantirishga harakat qilishdi. Koen va texnik Kristin Miller R-faktor plazmidlarini tozalashdan boshladilar. Keyinchalik, tadqiqotchi texnik Enni Chang va laboratoriyada ishlaydigan tibbiyot talabasi Lesli Xsu 1971 yilda tozalangan plazmidlarni yangi bakteriyalarga kiritishga muvaffaq bo'lishdi.

Koen tadqiqotchi Enni Chang bilan
[Stenford yangiliklari xizmati Chak Peynter izni bilan]

Chang va Koen, shuningdek, genlarni ajratish umidida, plazmidlarni qanday maydalashni o'ylab topishdi, lekin bu jarayon tasodifiy va tasodifiy edi. Ba'zida parchalar yangi dumaloq plazmidga yopishib oladilar, ammo tadqiqotchilar o'z natijalarini izchil takrorlay olmaydilar. Bu katta bo'lak singan spagettini aralashtirishga o'xshardi, ba'zi iplar kerakli kombinatsiyalarda bir -biriga yopishib ketadi deb umid qilgandek edi. Ularga plazmidlarda genlarni olib tashlash va qo'shishni nazorat qilish usuli kerak edi.

Jannatda qilingan o'yin

Multfilmda mashhur Gonolulu sho'rvasi uchrashuvi tasvirlangan. Stenli Folkov ("D" o'ylab), Herbert Boyer ("N"), Stenli Koen ("A"), Charlz Brinton (pastda chapda) va Ginger Brinton (pastda)
[Gonolulu reklama beruvchisi Dik Adair izni bilan]

Boyer cheklangan fermentlar, DNKni ma'lum ketma-ketlikda ajratadigan oqsilga asoslangan mashinalar ustida ishlagan. Masalan, EcoRI fermenti faqat GAATTC ketma -ketligini kesadi. Bu kesmalar "yopishqoq uchlar" hosil qiladi, shuning uchun olimlar keyinchalik yangi kombinatsiyalarda EcoRI kesilgan ikkita ketma-ketlikni yopishtirishlari mumkin. Boyer guruhi fermentni 1968 yilda uni ajratib olgandan keyin aniqlagan edi E. coli siydik yo'llarining dorilarga chidamli infektsiyasiga chalingan bemordan olingan. Gonoluluda Boyer va Koen tajribalarini salfetkaga yozdilar.

Kaliforniyaga qaytib, Koen guruhi plazmidlarni tozaladi E. coli. Keyin San -Frantsiskoda yashovchi Chang ularni Boyer laboratoriyasiga topshirdi, u erda tadqiqotchilar plazmidlarni cheklovchi fermentlar bilan kesib, so'ngra bo'laklarni boshqa tartibda yopishtirdilar. Ular DNKni Chang bilan Stenfordga qaytarib yuborishdi, u erda Koen guruhi uni bakteriyalarga joylashtirdi. Keyin olimlar bu bakteriyalardan plazmidlarni ajratib olishdi va tahlil qilish uchun ularni Boyerga qaytarib yuborishdi.

Boyer 2009 yilda bergan intervyusida plazmidlarning qayta joylashtirilganligini ko'rganini esladi PLoS genetikasi:

"Bu ko'zlarimga yosh keltirdi ... Men bilardimki, biz EcoRI yordamida kesilgan DNKning har qanday qismini, qaerdan kelganidan qat'i nazar, ajratib olishimiz mumkin."

Ammo ular DNKni boshqa organizmdan o'tkaziladigan plazmidlarga o'tkaza oladimi? E. coli? Ko'pgina olimlar DNK mos kelmaydi deb o'ylab, bunga shubha qilishdi.

Koenning pSC101 plazmidini EcoRI cheklovchi fermenti bilan kesish “yopishqoq uchlari”ni qoldiradi. Xuddi shu ferment bilan kesilgan boshqa DNK bo'laklari yopishqoq uchlariga kirib, yangi plazmid - pSC105 hosil qilishi mumkin.

Shunga qaramay, Koen va Chang boshqa bakteriya - Staphylococcus aureus plazmididan DNK bo'lagini plazmid orqali E. coliga kiritishga muvaffaq bo'lishdi. Keyin ular Boyer bilan kuchlarini birlashtirdilar va 1973 yilda hamkorlar oddiy laboratoriya hayvoni bo'lgan Afrika tirnoqli qurbaqasidan DNK bo'lagini olib, uni plazmid bilan E. coli ga ham joylashtirdilar. Turli xil DNK ketma-ketliklarining bunday bog'lanishi tezda "rekombinant DNK texnologiyasi" deb nomlana boshlaydi.’

Rekombinant DNK texnologiyasining yuksalishi

Ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, olimlar har qanday mavjudotning DNK ketma-ketligini "klonlash" uchun plazmidlar va cheklovchi fermentlardan foydalanishlari mumkin. Ular qo'shimcha o'rganish uchun ko'p miqdorda plazmid yasashlari mumkin edi. Boshqa olimlar hayajonlanishdi va Koendan o'zlarining tajribalari uchun plazmidlarini yuborishlarini so'rashdi.

Ammo tadqiqotchilar ham xavotirda edilar. Bu yangi yondashuv, shuningdek, olimlar g'ayritabiiy va potentsial xavfli genlarni ifoda etuvchi potentsial xavfli "Frankenorganizmlarni" yaratishi mumkinligini ham anglatardi. Agar ular antibiotiklarga chidamliligini hali bo'lmagan bakteriyalarga o'tkazib, yangi superbuglarni yaratsa nima bo'ladi? Yoki agar ular saraton keltirib chiqaradigan virusli genlarni bakteriyalarga solib, yangi saraton agentlarini yaratsa-chi?

Koen va Boyer, shuningdek Pol Berg kirgan qo'mita DNK aralash organizmlarining mumkin bo'lgan xavfini baholadi. 1974 yilgi maqolada, guruh olimlari antibiotiklarga qarshilik ko'rsatadigan genlarni bunday qarshilik ko'rsatmagan bakteriyalar turiga kiritmaslikni yoki hayvonlarning virusli genlarini plazmidlarga o'tkazmaslikni taklif qilishdi. Milliy Sog'liqni Saqlash Institutlari, shuningdek, Ebola virusi va boshqa o'ta xavfli patogenlarni o'rganish uchun ishlatiladigan, havfsiz himoyalangan inshootlarda eng xavfli eksperimentlarni o'tkazishni talab qiladigan ko'rsatmalarni chiqardi.

1977 yilda Science jurnalida chop etilgan maqolasida, Koen genetik muhandislik xavfi asosan spekulyativ, foydasi esa ancha yuqori ekanligini ta'kidladi.

"Bu haqiqatan ham siyosiy hamjamiyatni ilmiy jihatdan tarbiyalashga harakat qilish tajribasi edi", deb eslaydi u. “Men kongressmenlar, senatorlar va ularning xodimlari bilan ishlash uchun koʻp vaqt sarfladim.”

Olimlar ko'rsatmalarga amal qilishdi va vaqt o'tishi bilan Koen DNK rekombinatsiyasining ijobiy salohiyati haqida to'g'ri ekanligi ma'lum bo'ldi.

DNK plazmidining elektron mikrografi

1976 yilda Boyer Kaliforniyaning Oceanside shahridagi Genentech farmatsevtika kompaniyasini yaratish uchun 500 dollarlik dastlabki sarmoya kiritdi. Genentech olimlari inson insulin genini plazmidga ko'chirib, bakteriyalarga joylashtirdilar. Keyin bakteriyalar ushbu genni diabet bilan og'rigan odamlar uchun insulin chiqarish uchun ishlatgan. Keyinchalik, Genentech odamning o'sish gormonini ishlab chiqardi.

Rekombinant DNK inqilobi boshlandi. Bugungi kunda yuzlab biotexnologiya kompaniyalari saratondan gemofiliyaga qadar bo'lgan sharoitda dori -darmon ishlab chiqarish uchun rekombinant DNK texnologiyasidan foydalanadi. Laboratoriyada cheklov fermentlari va plazmidlar standart vositaga aylanib, olimlarga genlarni batafsil o'rganishga imkon berdi. Olimlar oziq-ovqatlarni yanada jozibali yoki to'yimli qilish uchun yangi genlarni ekin o'simliklariga o'tkazadilar. Ro'yxat davom etmoqda.

"Agar sizda klonlash texnologiyasi va plazmid bo'lmasa, siz hozir qilayotgan odamlarning hech bir ishini qilolmaysiz", deydi Miller, 2011 yilda nafaqaga chiqqunga qadar Koen laboratoriyasida ilmiy xodim.

Ayni paytda, Koen hali ham antibiotiklarga qarshilik muammosi ustida ishlamoqda, bakteriyalarning stressli sharoitlarga qanday moslashishini o'rganmoqda. U, shuningdek, takrorlanuvchi DNK ketma-ketligi Xantington kasalligi va mushak distrofiyasi kabi kasalliklarga qanday hissa qo'shishini o'rganmoqda.

"U shunchaki narsalarni o'rganishga, narsalarni topishga undaydi", deydi Miller. "U hali ham avvalgidek qattiq ishlamoqda."


Tasodifiy DNK ketma -ketligini kesuvchi cheklash fermenti ehtimolligi muammosi - Biologiya

1) Bakterial plazmidlarning o'lchami 1000 dan 200 000 gacha, ular klonlash uchun keng qo'llaniladi. Quyida chizilgan plazmidda quyidagi cheklash fermentlari uchun kesish joylari mavjud: EcoR1, Sal1 va BamH1. Kesish joylari orasidagi asosiy juftlikdagi masofa (bp) saytlar o'rtasida ko'rsatilgan. Biologiya haqidagi bilimlaringiz va (a) dan (e) gacha chizmalarga asoslanib, quyidagi savollarga javob bering.

a) EcoR1 cheklovchi fermenti bilan klonlash plazmidini kesib tashlaganingizdan so'ng jel elektroforez natijalaridan qaysi birini kutgan bo'lardingiz? Nega?

Taklif etilayotgan plazmidlarga EcoR1 cheklovchi fermentlarini kiritish har bir cheklash joyida ajralishlarga olib keladi. Bu plazmidni 3 xil qismga ajratadi. Bu bo'laklarning uzunligi 500, 800 va 1000 bosimli bo'ladi. Taxminan 500, 900 va 1000bp bo'lgan chiziqlar ma'lum DNK marker zanjiri yonidagi gel elektroforez blokida ko'rsatiladi. Belgilangan uzunliklarga mos keladigan, aniq 3 ta alohida satrga ega bo'lgan yagona gel -blok tanlovi - B blok.

b) Sal1 cheklash fermenti bilan klonlash plazmidini kesib tashlaganingizdan so'ng, yuqorida ko'rsatilgan jel elektroforezining qaysi natijalarini kutasiz? Nega?

Yuqorida aytilgan protseduradan foydalangan holda, hozir Sal1 cheklash fermenti yordamida uzunligi 800bp va 1600bp bo'lgan ikkita bo'lak yaratiladi. Ma'lumki, DNK markeriga nisbatan bu munosabatni aks ettiruvchi gel blok C blokdir. U 2 ta chiziqdan iborat bo'lib, birinchi satr blokda 500bp belgidan biroz kattaroq, ikkinchi chiziq esa bir oz pastroq. 2000bp belgisi. Bu hisoblangan qism uzunligiga mos keladi.

c) Klonlash plazmidini barcha uchta cheklovchi fermentlar - EcoR1, Sal1 va Bam1 bilan bir vaqtning o'zida kesib tashlaganingizdan so'ng, yuqorida ko'rsatilgan gel elektroforez natijalaridan qaysi birini kutishingiz mumkin? Nega?

Agar men EcoR1, Sal1 va Bam1 cheklovchi fermentlari yordamida plazmidni "kesib" olsam, men oltita bo'lakni yaratgan bo'lardim. Uzunligi 300bp, ikkitasi 500bp, uzunligi 200bp va uzunligi 600bp bo'lishi mumkin. Belgilangan uzunlikdagi tayanch juftlik uzunligiga DNK belgisi bilan eng mos keladigan, test chizig'ida to'rt xil chiziqli jel blok - D bloki. To'rt qatorli boshqa blok - E blokidir, uning eng uzun bo'lagi 10,000 bp. , plazmidning o'zidan to'rt baravar ko'p.

2) A chiziqli DNKning bir qismi individual cheklovchi fermentlar bilan parchalanadi HindIII va SmaMen va keyin ikkita fermentning kombinatsiyasi bilan. Olingan qismlar quyidagilar:

HindIII va SmaMen 2,5 kb, 3,0 kb, 2,0 kb

b) Birlashtirilgan fermentlar tomonidan hosil bo'lgan parchalar aralashmasi ferment bilan parchalanadi EkoRMen, natijada 3-kb bo'yalgan tasma yo'qoladi (elektroforez jeli ustida) va 1,5 kb bo'yalgan tasma paydo bo'ladi. Belgilang EkoRMen cheklash xaritasida saytni ajratuvchi sayt.

3) * YANGI VERSION * Sopining sochlarini tushuntiring.

3) Duchenne mushak distrofiyasi X ga bog'liq retsessiv kasallikdir. Kasallik qurbonlari hayotning boshidan boshlab asta-sekin zaiflashadi.

a) Akasi kasal bo'lgan ayolning kasal bolasi bo'lish ehtimoli qanday?

Men onada kasallik yo'q deb taxmin qilmoqchiman. Yana bir o'zgaruvchi bor, bu uning ota -onasiga ham ta'sir qilganmi yoki yo'qmi. Agar ayolning akasi kasallikka chalingan bo'lsa, ayolning onasi hech bo'lmaganda kasallik tashuvchisi bo'lishi kerak. Shuning uchun, aslida, savol ichida ikki xil holat yotadi. Agar ayolning onasi kasallikka chalingan bo'lsa, demak, ayol tashuvchidir va bolaga ega bo'lish ehtimoli 1/4 ni tashkil qiladi. Agar ayolning onasi faqat tashuvchi bo'lgan bo'lsa, lekin kasallikni bildirmagan bo'lsa, unda ayolning tashuvchisi bo'lish ehtimoli bor (chunki har 2 urg'ochi urg'ochi 1dan biri tashuvchisi bo'lishi mumkin) va uning bolasiga ta'sir qilish ehtimoli bor, bu umumiy ehtimollikni oshiradi. voqea 1/8.

b) Agar onangizning ukasi (aka sizning amakingiz) Dyuchenne mushak distrofiyasi bilan kasallangan bo'lsa, siz allelni qabul qilish ehtimoli qanday?

4) Hamrohlik qiluvchi nasl-nasab qobiliyatsiz, ammo o'limga olib kelmaydigan ma'lum bir noyob kasallikka tegishli.


Cheklovlarni xaritalash muammosi qayta koʻrib chiqildi

Hisoblash molekulyar biologiyasida maqsad cheklash xaritasi DNK molekulasida berilgan fermentning cheklanish joylarini aniqlashdir. Ikki marta hazm qilish va qisman hazm qilish cheklov xaritalashning yaxshi o'rganilgan ikkita usuli. Er-xotin hazm qilish NP-to'liq bo'lsa-da, qisman hazm qilish uchun ma'lum polinomli vaqt algoritmi yo'q. Yuqoridagi texnikaning yana bir kamchiligi shundaki, rekonstruksiya uchun bir nechta echimlar bo'lishi mumkin.

Ushbu maqolada biz oddiy texnikani o'rganamiz qisman hazm qilish bilan belgilanadi cheklash xaritalash uchun. Biz hamma narsani topish uchun tez polinomli vaqt (O (n 2 log n) eng yomon) algoritmini beramiz n Ushbu texnikadan foydalangan holda DNK molekulasining joylari. Algoritmning muhim afzalligi - bu noyob digestdan DNK molekulasini rekonstruksiya qilish. Texnika laboratoriyada yuzaga keladigan fragment uzunligidagi xatolarni hal qilishda ham mustahkamdir. Biz mustahkamlik beramiz O(n 4) O (Δ n) mutlaq xatoligiga toqat qila oladigan eng yomon algoritm (bu erda D - minimal saytlararo masofa), noyob rekonstruksiyani berish bilan birga. Biz nazariy natijalarimizni haqiqiy DNK molekulasida algoritm ishlashini simulyatsiya qilish orqali sinab ko'ramiz.

Belgilangan qisman hazm qilish muammosiga o'xshashlik bizni qiziqtirgan muammoni hal qiladi de novo peptidlar ketma-ketligi muammo (Diskret algoritmlar bo'yicha ACM-SIAM simpoziumi (SODA), 2000, 389-398-betlar), bu oqsil molekulasining peptid ketma-ketligini qayta tiklashda paydo bo'ladi. Biz dinamik dasturlashdan foydalanmasdan muammoning sodda va samarali algoritmini beramiz. Algoritm O (k log k) vaqtida ishlaydi, bu erda k Bu ionlar soni va Chen va boshqalarning algoritmini takomillashtirishdir.


RADseq uchunmi yoki RADseq emasmi?

Oxir -oqibat, biz hammamiz qo'limizdan kelganicha byudjet bo'yicha eng yaxshi fanni qilishni xohlaymiz.

(A) Lowry 3 -rasm va boshqalar. (2016) va (B) bu raqamning MakKinni tomonidan kengaytirilishi va boshqalar. (2017). Qo'shish uchun tahrirlangan:Har bir panel turli o'rtacha bog'lanish masofalarini hisobga olgan holda, tasodifiy taqsimlangan RAD lokuslarining ma'lum soni bilan “qoplangan” simulyatsiya qilingan genomning ulushini chizadi. Turli xil chiziq uslublari simulyatsiya qilingan genomlarning turli o'lchamlarini ko'rsatadi.

Albatta, ushbu jadvaldagi 30 tur ilmiy o'rganish uchun qiziq bo'lgan barcha turlarni va barcha populyatsiyalarni keng ifodalaydi, deb kutish haqiqatga to'g'ri kelmaydi. va boshqalar. (2016) 1 -jadvaldagi turlarning oltitasida (20%) LD baholari 100 Kb dan katta yoki undan kattaroq ekanligini, ularning uchtasida LD ko'rsatkichlari 1 Mb yoki undan yuqori bo'lganligini ham ko'rsatmagan …

Lowry -ning qo'llab -quvvatlovchi ma'lumotlaridan kodni ishlatish va boshqalar., MakKinni va boshqalar. Breaking RAD qog'ozidan asosiy raqamni uzating, agar bog'lanish haqiqatan ham Lowrydan uzoqda bo'lsa va boshqalar. Faraz qilaylik, odatiy RADseq protokoli ko'p gigabazali genomlarning 100% ini tashkil qilishi mumkin. Men ularning bahsining mohiyatini shunday ta'riflayman, nima uchun eng yomon deb o'ylaysiz? Qachonki, RADseq asosidagi genom skaneridan nomzodlar funktsional rollarning isboti yoki mustaqil ma'lumotlarga asoslangan tanlov tarixini ko'rsatsa, men aytamanki, ular nuqta topdilar. RADseq topa olmasa ham har genom haydash moslashuvining bir qismi, topish biroz qismlar yaxshi boshlanishdir va katta yutuq bo'lishi mumkin. Shunga qaramay, agar biz moslashuv umuman qanday ishlashini tushunmoqchi bo'lsak, oxir-oqibatda biz hatto alohida holatlarning to'liq rasmini yaratmoqchimiz.
Variantlar yaxshiroqmi?
Ikkinchi javob qog'ozi, Julian Catchen tomonidan yozilgan, RADseq -ning bir nechta asl mualliflari tomonidan yozilgan va ular, agar RADseqning cheklovlari bo'lsa ham, alternativalar, albatta, yaxshiroq emas, deb bahslashadi. Lowry va boshqalar. RADseq genomini tasodifiy qisqartirishdan ko'ra, ketma-ketlik xarajatlarini kamaytirishga maqsadli yondashishni taklif qiling yoki RNAseq yordamida faqat ifodalangan genlarni ketma-ket keltiring yoki RNAseqdan yoki mos yozuvlar izohidan aniqlangan oqsillarni kodlovchi genlarni ekzomani qo'lga oling. genom Bu erda mantiq shuki, agar siz butun genomni tartiblashtirishga qodir bo'lmasangiz, nima etishmayotganingizni ham bilishingiz mumkin. (Bu holda, kodlanmagan hududlar, shu jumladan potentsial muhim tartibga solish elementlari o'tkazib yuborilishini tushunib, oqsil-kodlovchi hududlarni nishonga olish.) Bundan tashqari, populyatsion allellarning chastotalarini butun genomli qamrovli ketma-ketlik yordamida baholash mumkin. Qaysi birma-bir genomik namunalar teng nisbatda aralashtiriladi va “pool” hosil bo'ladi, so'ngra ketma-ketlashtiriladi, agar yetarlicha namunalar to'plangan bo'lsa va birlashtirish jarayoni aniq bo'lsa, bu juda kamroq allel chastotalari bo'yicha yaxshi baho berishi mumkin. har bir namunani alohida tartiblash uchun kerak bo'lgandan ko'ra ketma -ketlik.
Catchen va boshqalar. RNAseq cheklovlari, ekzomani qo'lga kiritish va yig'ilishlar ketma -ketligi ularni RADseq hali ham ishlay oladigan holatlarda qo'ldan chiqarib yuboradi. RNKning ketma -ketligi o'zgaruvchan genlar ifodasi bilan bir xil bo'lishi mumkin, shu bilan birga ekzomani yig'ish va yig'ish ketma -ketligi yaxshi mos yozuvlar genomiga yoki hech bo'lmaganda transkriptomga tayanadi, bu massiv dizayni qo'lga kiritish yoki genotiplash uchun to'plangan ketma -ketlikni moslashtirish uchun. Shuningdek, ular RADseq ma'lumotlari yordamida bog'lanish darajasini baholashning to'liq mumkinligini ta'kidlaydilar, shuning uchun RADseq foydalanuvchilari genom tekshiruvini o'tkazishdan oldin o'z ma'lumotlarining mosligini baholashlari mumkin. Birlashtirilgan ketma-ketlikda bu mumkin emas, chunki protokol individual genotiplarni yo'q qiladi.
Buning uchun qishloq kerak (genomik resurslar)
Ushbu javoblarga javoban Louri va boshqalar. ularning argumenti RADseqga usul sifatida qarshi emas, balki o'rganilayotgan turning biologiyasi va genom tuzilishini to'g'ri tushunmasdan foydalanishga qarshi ekanligini ta'kidlaydi. RADseq-dan foydalangan holda ko'plab individual tadqiqotlar ushbu ehtiyot choralarini ko'rishi aniq bo'lsa-da, boshqalari bunday emas. Ular ilgari "RADseq" yoki boshqa turdagi "8212" turidagi molekulyar ekologik tadqiqotlar izohli genom yoki bog'lanish xaritasining infratuzilmasini qurishdan boshlashini yoki har ikkala tadqiqot dizaynini modelga asoslangan kuch bilan xabardor qilishni tavsiya qiladi. tahlil qilish va genom-skanerlash tahlillarida topilgan nomzod lokuslari populyatsiya genomikasidan tashqari ma'lumotlar bilan tasdiqlangan. Ular xulosa qilganda

Biz barcha ssenariylar bo'yicha aniqlash usullarini qo'llab-quvvatlamadik va qo'llab-quvvatlamadik, faqat tergovchilar RADseq, genomning to'liq yig'ilgan ketma-ketligi, RNK-sek va ketma-ketlikni o'rganish masalasi, genom o'lchami, va LD ning kutilayotgan shakllari. Biz eksperimental dizaynlarni sinchkovlik bilan ko'rib chiqishni va ular paydo bo'lganda xatolarni tan olishni qo'llab -quvvatlaymiz.


BioPython yordamida cheklangan joylar uchun DNK ketma -ketligini tekshirish uchun foydalanuvchi kiritishi

Men foydalanuvchi kiritgan cheklash fermenti nomini (shuning uchun mag'lubiyatni) qabul qiladigan va cheklangan fermentlar ketma -ketligi uchun berilgan DNK ketma -ketligini (shuningdek, qatorni) tahlil qiladigan skript yozmoqchiman. Kirish Bio.Restriction moduli tarkibidagi cheklash fermentlari kutubxonasiga kirishi mumkin. Juda oddiy misol:

Muammo, albatta, o'zgaruvchida ferment sinfga kirish uchun zarur bo'lgan RestrictionType ob'ekti emas, mag'lubiyatli ob'ekt.

Importlib paketini ishlatishga harakat qildim. Fermentlar modullar o'rniga sinflar bo'lib ko'rinadi, shuning uchun importlib yordam bera olmaydi.

Men Python -da juda yangi, shuning uchun men cheklash manba fayllarini o'qishdan juda ko'p foyda olmadim.

Buyruq satrida cheklash fermentiga kirishga majbur bo'lishda aniq cheklovlar mavjud. Ushbu muammoni hal qilishning bir usuli - ikkita python skriptiga ega bo'lish, ulardan biri foydalanuvchidan fermentni so'raydi va keyin kodni almashtiradi va boshqa skriptdan mahsulot import qiladi. Yana bir yechim - barcha mumkin bo'lgan fermentlar va ularning saytlari lug'atini yaratish. Bu ikkala echim ham dahshatli. Men uchun ideal yechim foydalanuvchi kiritgan satrni saytlarga kirish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan tegishli RestrictionType ob'ektiga aylantirish bo'ladi. O'qiganingiz uchun tashakkur va men bu muammoni hal qilishda yordam berganidan minnatdorman.


Oltin darvoza assambleyasi uchun PaqCI&trade-dan foydalanish - uni NEB Assambleyasi portfeliga nima maxsus qo'shimcha qiladi?

PaqCI ning o‘ziga xos xususiyatlariga o‘tishdan oldin, keling, bosqichni belgilash uchun bir oz ferment fonini o‘rganib chiqamiz: Oltin darvoza assambleyasi to‘g‘ridan-to‘g‘ri IIS turidagi cheklash fermentlariga bog‘liq bo‘lib, ular assimetrik DNKni tanib olish joylariga ega va ularni tanib olish yoki bog‘lash ketma-ketligidan tashqarida bo‘linadi. . Hozirda biz IIS tipidagi 50 ta cheklash fermentlarini taklif qilamiz, ularning bir qismi Oltin darvoza yig'ilishi uchun zarur bo'lgan qulay xususiyatlarga ega. BsaI-HF & regv2, BsmBI-v2 va BbsI-HF & reg kabi fermentlar bizning "Oltin darvoza" ishchi kuchlarimiz edi, chunki ular ilmiy adabiyotlarda nashr etilgan yig'ilish protokollarida tarixan tasvirlangan va biz bu erda NEBda katta tajribaga egamiz. Shu vaqt ichida va mijozlarimizning maʼlumotlari bilan biz tadqiqot hamjamiyatiga yigʻish uchun 7 ta asosli tanib olish joyiga ega fermentni taklif qilish qanchalik foydali boʻlishini tushundik, biroq ulardan biri &ldquoNEB Way&rdquo &ndash toʻliq optimallashtirilgan protokollar va ferment tavsiyalari bilan amalga oshirildi. , oddiydan murakkabgacha bo'lgan yig'ilishlar uchun va o'rtacha narxda.

PaqCI "Oltin darvoza" hikoyasi shu erda boshlanadi, chunki biz 7-bazali tan olinadigan juda kerakli saytga ega IIS tipli fermentni topish yo'lini belgilaymiz (1-rasmga qarang), ularning saytlari DNK ketma-ketligida kamroq bo'ladi. yig'ilgan, ammo olimlar o'z tajribalari uchun talab qiladigan yig'ilish murakkabligining to'liq doirasiga qodir. Tadqiqot, ilovalarni ishlab chiqish va ishlab chiqarish bo'limlarimizdagi laboratoriyalar o'rtasidagi hamkorlik natijasida PaqCI aniqlandi va klonlandi va uning ifodasi optimallashtirildi. Shuningdek, biz ferment uchun DNK aktivatorini optimallashtirdik va bitta qo'shimchalar va oddiydan murakkabga yig'ilishlar uchun protokollarni ishlab chiqdik. Bularning barchasi kashfiyotdan tortib to optimallashtirishgacha, sotuvga qo'yilgunga qadar va pandemiya paytida ilm -fanni olib borishda biz duch kelgan qiyinchiliklarga qaramay!

1-rasm: IIS tipidagi fermentlar assimetrik DNK ketma-ketligini taniydi va ularni tanib olish ketma-ketligidan tashqarida ajraladi.

Uylashtirish nima? Va nima uchun PaqCI xonakilashtirishni ko'rib chiqishda muhim?

Uyda saqlash yig'ilishning bir qismi bo'lgan har qanday DNK fragmentini &ldquoGolden Gate-ga tayyor&rdquo shakliga aylantirishni nazarda tutadi - DNKni ikkala uchida yig'ilishni boshqaradigan IIS turi cheklash joylari bilan yonma-yon joylashtirish va mavjud bo'lishi mumkin bo'lgan ferment uchun har qanday ichki joylarni olib tashlash. DNKda va GGAda yaxshi muhosaba qilinmaydi. PaqCI uchun, bu 7-bazali tan olinadigan sayt haqida, har qanday 7-asosli ketma-ketlik, har qanday DNK ketma-ketligida, tez-tez ishlatiladigan IIS tipidagi cheklash fermentlarining 6-asosli ketma-ketligidan ko'ra kamroq bo'ladi. "Oltin darvoza" ning Axilles va rsquo to'pig'i har doim ichki saytlar bo'lgan sezilarli darajada yig'ish samaradorligini pasaytiradi, chunki ular tayyor tuzilmani yig'ish reaktsiyasida mavjud bo'lgan cheklash fermenti tomonidan hazm bo'lishga moyil bo'ladi va eng yomon holatda noto'g'ri va keraksiz yig'ilishlarga olib kelishi mumkin.

Oltin darvozani bitta qo'shimchani klonlash uchun ishlatishda bu unchalik muammo emas, chunki bitta qo'shimchaning umumiy samaradorligi juda yuqori, agar siz muvaffaqiyatli klonlangan qo'shimchalarning ko'pchiligi chiziqli bo'lib, bir nechta koloniyalarni skrining qilish orqali o'zgarmasa ham, siz xohlagan konstruktsiyani olasiz. O'zgartirish plastinkasidan siz klonlangan bitta qo'shimchalarni topasiz. Odatda, tadqiqotchilar "Golden Gate" dan bir nechta qo'shimchalar uchun foydalanadilar. Qanchalik ko'p qo'shimchalar mavjud bo'lsa&mdash yig'ish murakkabligi shunchalik katta bo'ladi va sizga maksimal samaradorlik shunchalik ko'p kerak bo'ladi. Shunday qilib, siz tanlagan cheklash fermenti uchun ichki saytga ega bo'lish Golden Gate Assambleyasi uchun katta muammodir.

DNK ketma-ketligini xonakilashtirishda ichki joylarni yo'q qilish uchun tasdiqlangan metodologiyalar mavjud. Bizda (quyida) uy sharoitida etishtirish variantlari ko'rsatilgan video bor: (1) yig'ilish reaktsiyasidan oldin ichki joyni yo'q qilish uchun saytga yo'naltirilgan mutagenez yoki (2) ichki cheklov joyida yig'ilish nuqtasini loyihalash. montajdan keyin saytni yo'q qilish uchun bazani o'zgartirish.

Bu videoda "Golden Gate Assambleyasi" ga tegishli bo'lgan uy sharoitida yoki IIS tipidagi kesilgan joylarni tabiiy ravishda vektor yoki qo'shimchalar ketma -ketligida olib tashlash tushuntiriladi.

Ammo ichki saytlar bilan shug'ullanish uchun barcha bu ketma-ketlik manipulyatsiyasi o'ylash va vaqt talab etadi. Shunday qilib, 7-bazali tanib oluvchi fermentning jozibadorligi ichki saytlar ehtimolini sezilarli darajada kamaytiradi. Va bu erda PaqCI rasmga tushadi va Oltin darvoza yig'ilishi uchun optimallashtirilgan va 20 dan ortiq fragmentlargacha murakkab yig'ilishlar uchun foydalanish imkonini beruvchi kontsentratsiyada ta'minlangan 7 ta asosli tanib olishni cheklash fermenti. Biz bundan juda xursandmiz!

Ko'p saytli fermentlarning mexanizmi va nima uchun ular aktivator qo'shilishidan foyda ko'radi

Ba'zi fermentlar boshqalarga qaraganda DNKdagi o'zlarining tanib olish joylari bilan o'zaro ta'sir qilishning murakkab usullariga ega. Ko'p turdagi homodimerik fermentlar, standart tip IIP cheklash fermentlari EcoRI va HindIII singari, ikkita bir xil bo'lakka ega bo'lib, ular simmetrik maydonda bir-biriga bog'lanib, har bir bo'linma bitta ipni kesib, ikki qatorli kesishga olib keladi. Bundan farqli o'laroq, PaqCI kabi ko'p saytli fermentlar ancha murakkab tuzilishga va mexanizmga ega. Taxmin qilinishicha, PaqCI bitta maqsadli saytni ajratish uchun ikkita taniqli sayt bilan o'zaro aloqada bo'lish uchun bir nechta bo'linmalardan foydalanadi. Oltin darvozani yig'ish paytida PaqCI barcha saytlarni kesishiga ishonch hosil qilish uchun biz qo'shimcha PaqCI bog'lanish joyini o'z ichiga olgan inert qisqa oligonukleotid aktivatorini etkazib beramiz, u transda PaqCI bo'linishi uchun faollashtiruvchi sifatida ishlaydi (2-rasmga qarang).

2-rasm: PaqCI aktivatori kerak bo'lganda trans bog'lash orqali to'liq kesishni ta'minlaydigan taxminiy mexanizm

Oltin darvoza uchun, ta'rifiga ko'ra, har bir qo'shimcha va har bir maqsadli plazmidning yig'iladigan faol DNK fragmenti ikkita joy bilan yonma-yon joylashgan bo'lsa, qo'shimcha saytlarga ehtiyoj qolmaydi deb o'ylash mumkin. But Golden Gate is a very dynamic process, with cutting and ligation taking place in the assembly reaction, and situations can arise where PaqCI binds and cuts sites on different DNA molecules, which means on each of those DNA molecules there would be another site remaining to be cut. So having an optimized number of extra sites available in the form of the PaqCI activator ensures that complete cutting in your assembly reaction occurs. It should be noted that the activator does not get cut or interact in any way with the assembly &ndash it only provides a second binding site that can activate cutting. Different levels of complexity call for different levels of PaqCI and T4 DNA Ligase in addition we have carefully optimized how much PaqCI and its activator are needed for different assembly complexities.

Now, it gets interesting when we think about what exactly constitutes the right amount activator. The cutting of DNA in a typical DNA restriction digest, where cut DNA remains cut, is different from what happens in Golden Gate assembly reactions, where sometimes cut sites are nonproductively reannealed and ligated, so that any one DNA cut site can require being cut more than once throughout the assembly reaction. This is why the optimal amount of the activator can be different from what is recommended for a standard restriction digest with PaqCI, where using 1 µl of the enzyme (10 U) requires 1 µl of the activator (20 pmoles). Because of the dynamic nature of GGA, these regenerated sites translate to less supplementary sites in the form of the activator being needed.

From over a thousand test assembly reactions, we can recommend just the right amount of PaqCI, activator, and T4 DNA Ligase for everything from simple single insert cloning to a complex 24-fragment assembly (see Table 1).

  1. Based on 5 fragment assembly test system
  2. Based on 24 fragment assembly test system
  3. The activator solution is in a Mg-free buffer for best long-term storage. For short-term working stocks, if desired, dilute an appropriate amount in 1X T4 DNA ligase buffer to achieve more easily pipettable volumes (e.g., a four-fold dilution = 5 µM, 5 pmoles/µl activator.)

Table 1: Recommendations for PaqCI Golden Gate Assembly

As assembly reactions increase in complexity, more units of enzyme are required for maximal performance our range is from 5 to 20 U of PaqCI paired with 200-800 U of T4 DNA Ligase. We also have recommendations for how much of our activator to add to each assembly reaction, within a range of 5-10 pmoles. We provide a 20 µM stock of the activator with each PaqCI enzyme, more than enough for all your assembly needs.

One note about the buffer requirements: CutSmart buffer is the best buffer to use for setting up a simple DNA digest with PaqCI, but for Golden Gate Assembly, there are better efficiencies achieved maximizing the PaqCI and T4 DNA ligase enzyme activities using T4 DNA Ligase Reaction Buffer.

New England Biolabs Golden Gate Assembly tools are here to help

Webtools make our scientific lives simpler by facilitating workflows, and our Golden Gate Assembly tool keeps to that tradition.

After designating the DNA fragments you would like to use for any given assembly, the tool can design optimal unique four base overhangs between the inserts that have been independently verified through T4 DNA Ligase fidelity studies to work at high fidelity. It will also automatically check your inserts for the presence of any internal sites that might affect the choice of Type IIS restriction enzyme to direct an assembly, or alert the user to remove such internal sites via domestication. The program will also automatically generate a set of primers for your inserts to add the flanking bases and recognition sites required either for amplicon generation of inserts to be directly used or for pre-cloning purposes. Finally, a report can be generated describing your full assembly with a color-coded graphical read out, your final assembly sequence, and descriptions of each junction between inserts.

In addition, there are also useful programs available under the &ldquoUtility&rdquo tab within the tool. Those programs can take an uploaded sequence and make suggestions for different desired insert or module design and can also provide you with vetted lists of what overhangs have been found to support high efficiencies and fidelities during Golden Gate Assembly. Together the Golden Gate Assembly tool makes assembly design easy, even for the first time user!

Check out our video outlining the Golden Gate Assembly workflow, our usage guidelines for GGA using PaqCI, or our protocol for GGA using PaqCI and T4 DNA Ligase.

NEB will not rent, sell or otherwise transfer your data to a third party for monetary consideration. See our Privacy Policy for details. View our Community Guidelines.

Don't miss out on our latest NEBinspired blog releases. You can sign up to receive our e-newsletter!

Or download your favorite feed reader app and click the link below to subscribe to our RSS feed.

Be part of NEBinspired. Submit your idea to us to have it featured in our blog..


Muammo

Say that you place a number of bets on your favorite sports teams. If their chances of winning are 0.3, 0.8, and 0.6, then you should expect on average to win 0.3 + 0.8 + 0.6 = 1.7 of your bets (of course, you can never win exactly 1.7!)

More generally, if we have a collection of events $A_1, A_2, ldots, A_n$ , then the expected number of events occurring is $mathrm(A_1) + mathrm(A_2) + cdots + mathrm(A_n)$ (consult the note following the problem for a precise explanation of this fact). In this problem, we extend the idea of finding an expected number of events to finding the expected number of times that a given string occurs as a substring of a random string.

Given: A positive integer $n$ ( $n leq 1,000,000$ ), a DNA string $s$ of even length at most 10, and an array $A$ of length at most 20, containing numbers between 0 and 1.

Return: An array $B$ having the same length as $A$ in which $B[i]$ represents the expected number of times that $s$ will appear as a substring of a random DNA string $t$ of length $n$ , where $t$ is formed with GC-content $A[i]$ (see “Introduction to Random Strings”).


VI. Xulosa

DNA-based circuit design is continually evolving as DNA paradigms can be developed to represent their digital counterparts. Current efforts of our research team are dedicated to the utilization of these developments in the design of security applications. This presentation demonstrates how a microfluidic device can act as a random number generator, a fundamental element in security circuitry. Oligonucleotide synthesis is used to randomly generate a nucleotide sequence, plasmid vectors enable temporary storage of the sequence, and chromatogram analysis enables the translation from a sequence to its digitally equivalent random number. Long term storage is achieved through spotted microarray fabrication, which enables each sequence's expression levels to be permanently stored.


Videoni tomosha qiling: YÖS IQ Sayı Dizileri - Çıkma Olasılığı Yüksek Soru Çözümleri (Sentyabr 2022).


Izohlar:

  1. Abdul-Muhaimin

    OK filmmi?

  2. Ivan

    Iqtidorli...

  3. Kazrat

    Kechirasiz, lekin bu variant menga mos kelmaydi.

  4. Burl

    Uzr, uzoq

  5. Chadwick

    Ajoyib, bu kulgili ibora

  6. Hale

    thanks, I will try

  7. Stigols

    Men uchun saytga ma'lumot berish uchun ko'p miqdorda ma'lumot bering.

  8. Durwin

    Men bugun mavzuda ko'p o'qiyman.



Xabar yozing