Ma `lumot

8.2: Agaroz jelini tayyorlang - Biologiya

8.2: Agaroz jelini tayyorlang - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ushbu laboratoriyada siz PCR reaktsiyalarida hosil bo'lgan DNK molekulalarini ajratish uchun agaroz jellaridan foydalanasiz. Agar siz BioRad apparatlaridan foydalanayotgan bo'lsangiz, quyma patnisning har bir uchiga qora takozlarni joylashtiring.

1. Quyma platformangizga mos keladigan 1,25% (1,25 g/100 ml) jel uchun kerak bo'ladigan agaroza miqdorini aniqlang. Laboratoriyadagi jel apparatlarining aksariyati BioRad Mini-Sub GT tizimlari bo'lib, 30 ml jel sig'adigan 7 sm x 7 sm o'lchamdagi quyma patnisga ega. Davom etishdan oldin jamoadoshlaringiz bilan hisob-kitoblaringizni tekshiring.

2. TAE buferining tegishli hajmi bilan gradusli tsilindrni to'ldiring. Eritmani kichik kolbaga quying.

3. Agarozning tegishli miqdorini torting. Agarozni kolbadagi TAE yuzasiga seping. Eslatma: agaroz qizdirilmaguncha erimaydi.

4. Mikroto'lqinli pechda 15-20 soniya oralig'ida eritmani qizdirish orqali agarozni eritib yuboring. Har bir oraliqdan keyin kolbani olib tashlang va tarkibini tarqatish uchun uni biroz aylantiring. Agaroz zarralari hali ham aniq bo'lsa yoki agaroz erigan bo'lsa, e'tibor bering. Eng yaxshi jellar haddan tashqari pishirilmagan agarozadan tayyorlanadi.

XAVFSIZLIK BO'YICHA Izoh: Agaroz eritmasi uni mikroto'lqindan olib tashlaganingizda juda issiq bo'ladi! Shisha bilan ishlaganda ehtiyot bo'ling. Kolbaning ochilishi orqali keladigan bug'ga tegmaslik uchun ayniqsa ehtiyot bo'ling. Bir nechta qog'oz sochiqni katlayın va uni qo'llaganingizda kolbaning bo'yniga o'rang. Agar teringizga bir oz issiq agaroz to'kilsa, uni darhol sovuq suv bilan yuving va TA ga xabar bering.

5. Agaroz eritmasini kolbaga qo'lingiz bilan qulay tegizguningizcha sovishini kuting. Agaroza eritmalari 60 ̊C dan yuqori bo'lsa, quyma laganda buziladi! Jelni to'kib tashlang. Namuna taroqini joyiga qo'ying. Jel o'rnatilmaguncha quyma platformani harakatlantirmang. Jel shaffof bo'lganda o'rnatilganligini bilib olasiz. Jel o'rnatilgandan keyin taxminan 20 daqiqa davomida quritilishiga ruxsat bering.


Nuklein kislota elektroforez ta'limi

Nuklein kislotalarni ajratish va tahlil qilish uchun jel elektroforezi bo'yicha asoslar va maslahatlar haqida bilib oling.

Tarix, sozlash, ish jarayoni, mulohazalar, ilovalar va muammolarni bartaraf etishni o'z ichiga olgan nuklein kislota gel elektroforezi bo'yicha texnik resurslarni toping.


USLUB

Agaroz gel elektroforezi DNKni ajratish va tahlil qilishning eng oson va keng tarqalgan usuli hisoblanadi. Jelning maqsadi DNKni ko'rib chiqish, uning miqdorini aniqlash yoki ma'lum bir guruhni ajratish bo'lishi mumkin. DNK jelda mutagen bo'lgan etidiy bromid yoki GelRed, GelGreen va SYBR Safe kabi kamroq toksik bo'yoqlar qo'shilishi bilan ko'rsatiladi. Etidium bromidi va xususiy bo'yoqlar DNK bilan bog'lanadi va lyuminestsentdir, ya'ni ular ko'rinmas UV nurini o'zlashtiradi va energiyani ko'rinadigan yorug'lik sifatida uzatadi.

Qancha foiz jel?

Aksariyat agaroz jellari 0,7% dan 2% gacha ishlab chiqariladi. 0,7% gel katta DNK fragmentlarini (5󈝶 kb) yaxshi ajratilishini (rezolyutsiyasini) ko'rsatadi va 2% gel kichik fragmentlar uchun yaxshi ruxsatni ko'rsatadi (0,2𔂿 kb). Ba'zi odamlar juda mayda bo'laklarni ajratish uchun 3% gacha ko'tariladi, ammo bu holda vertikal poliakrilamid jeli ko'proq mos keladi. Past foizli jellar juda zaif va ularni ko'tarmoqchi bo'lganingizda sinishi mumkin. Yuqori foizli jellar ko'pincha mo'rt bo'ladi va bir tekis qolmaydi. Men odatda 1% jel tayyorlayman.

Qaysi gel tank?

Kichik 8x10 sm jellar (minigellar) juda mashhur va yaxshi fotosuratlar beradi. Kattaroq jellar Janubiy va Shimoliy blot kabi ilovalar uchun ishlatiladi. Minigel uchun zarur bo'lgan agaroza hajmi 30󈞞 ml atrofida, kattaroq jel uchun esa 250 ml bo'lishi mumkin. Ushbu usul siz mini-jel tayyorlayotganingizni nazarda tutadi.

Qancha DNK yuklashim kerak?

Katta savol. Siz shunchaki DNKingizni ko'rish uchun analitik jel tayyorlayotgan bo'lishingiz mumkin. Shu bilan bir qatorda, keyingi davolash uchun DNK bo'lagini jeldan kesishdan oldin uni ajratish uchun preparat jelini tayyorlayotgan bo'lishingiz mumkin. Qanday bo'lmasin, siz etidiy-bromid bilan bo'yalgan jelda UV nurlari ostida DNK chiziqlarini ko'rishni xohlaysiz. Odatda, tasma 20 ng ga yaqin DNKni o'z ichiga olsa, osongina ko'rinadi.

Endi bir misolni ko'rib chiqing. Aytaylik, siz 3 kb vektor va 2 kb insertdan iborat plazmidni hazm qilyapsiz. Siz EcoRI (umumiy cheklash fermenti) dan foydalanyapsiz va siz uchta diapazonni ko'rishni kutmoqdasiz: chiziqli vektor (3 kb), qo'shimchaning 5' uchi (0,5 kb) va qo'shimchaning 3' uchi (1,5 kb). Eng kichik diapazonni (0,5 kb) ko'rish uchun siz uning tarkibida kamida 20 ng DNK bo'lishini xohlaysiz. Eng kichik band kesilmagan plazmidning 1/10 qismidir. Shuning uchun siz 10x20 ng, ya'ni 200 ng DNKni (0,2µg) kesishingiz kerak. Keyin sizning uchta bandingiz mos ravishda 120 ng, 20 ng va 60 ng DNKni o'z ichiga oladi. Jelda barcha uch tasma aniq ko'rinib turadi va eng katta band eng kichik banddan olti marta yorqinroq bo'ladi.

Endi tasavvur qiling-a, bir xil plazmidni BamHI (boshqa mashhur cheklovchi ferment) bilan kesib oling va BamHI uni chiziqli qilish uchun plazmidni faqat bir marta kesib tashlaydi. Agar siz bu holda 200 ng DNKni hazm qilsangiz, tarmoqli 200 ng DNKni o'z ichiga oladi va juda yorqin bo'ladi.

Juda ko'p DNK jelga yuklash yomon narsa. Tarmoq tez ishlayotganga o'xshaydi (u haqiqatdan ham kichikroq ekanligini anglatadi) va o'ta og'ir holatlarda boshqa bantlar uchun elektr maydonini buzishi mumkin, bu esa ularni noto'g'ri o'lchamda ko'rsatishi mumkin.

Juda kam DNK Faqat muammo shundaki, siz eng kichik chiziqlarni ko'ra olmaysiz, chunki ular juda zaif.

Bularning barchasini aytib bo'lgach, DNK jellari kechirimli va DNK yuklarining keng doirasi maqbul natijalarni beradi. Men odatda hazm va yuk 2𔃂 µL to'plami miniprep olingan 50 µL. PCR reaktsiyalari uchun bu PCRga bog'liq, ammo muntazam ilovalarda jelda mahsulotni ko'rish uchun 10󈞀 µL ko'p bo'lishi kerak.

Qaysi taroq?

Bu siz yuklayotgan DNK hajmiga va namunalar soniga bog'liq. Ko'p mayda tishlari bo'lgan taroqlar 10 µL sig'ishi mumkin. Agar siz 20 µL cheklash dayjestini va 5 µL yuklash buferini yuklamoqchi bo'lsangiz, bu yaxshi emas. Taroqning tishlari etarli yoki yo'qligini hal qilishda, kamida bitta marker chizig'ini, yaxshisi ikkitasini yuklashingiz kerakligini unutmang.

Jel tayyorlash (1% jel uchun, 50 ml hajm)

0,5 g agarozani 250 ml konussimon kolbaga torting. 50 ml 0,5xTBE qo'shing, aralashtirish uchun aylantiring.

Mikroto'lqinli pechga to'g'ri kelsa, katta idishni ishlatish yaxshidir, chunki agaroza osongina qaynaydi.

Agarozni eritib yuborish uchun mikroto'lqinli pechda taxminan 1 daqiqa.

Agaroz eritmasi juda oson qaynashi mumkin, shuning uchun uni tekshirishda davom eting. 45 soniyadan so'ng uni to'xtatib, uni aylantirib berish yaxshidir. U haddan tashqari qizib ketishi mumkin va uni olib tashlamaguningizcha qaynab ketmasligi mumkin. Shunday qilib qo'lqop kiying va qo'llar uzunligida ushlab turing. Mikroto'lqinli pech o'rniga bunsen go'shtidan foydalanishingiz mumkin - shunchaki uni tomosha qilishni unutmang.

Uni skameykada 5 daqiqa davomida taxminan 60ºC ga qadar sovushini qoldiring (yalang qo'lda ushlab turish uchun juda issiq).

Agar siz agarozni eritib yuborish uchun uni uzoq vaqt qaynatishingiz kerak bo'lsa, unda siz suv bug'iga ozgina suv yo'qotgan bo'lishingiz mumkin. Siz kolbani isitishdan oldin va keyin torting va yo'qolgan hajmni to'ldirish uchun ozgina distillangan suv qo'shing. Agaroza soviyotganda, jel idishini tekis yuzaga tayyorlang.

1 µL etidiy bromid (10 mg/ml) qo'shing va aralashtirish uchun aylantiring.

Agarozning bu bosqichdan oldin biroz sovishini ta'minlashning sababi etidiy bromid bug'ining ishlab chiqarilishini minimallashtirishdir. Etidium bromidi mutagen va juda ehtiyotkorlik bilan ishlash kerak. Kontaminatsiyalangan uchini etidiy bromidli maxsus chiqindi idishiga tashlang. 10 mg/ml etidiy bromid eritmasi tabletkalar yordamida tayyorlanadi (changni tortmaslik uchun) va 4ºC haroratda TOXIC yorliqlari bilan qorong'i joyda saqlanadi.

Toksik va mutagen etidiy bromiddan foydalanishning muqobil variantlari mavjud:

Jelni asta-sekin idishga quying. Bir marta ishlatiladigan uchi yordamida pufakchalarni chetga suring. Taroqni joylashtiring va uning to'g'ri joylashtirilganligini ikki marta tekshiring.

Sekin quyishning afzalligi shundaki, ko'pchilik pufakchalar kolbada qoladi. Kolbani darhol yuvib tashlang.

Iloji bo'lsa, qopqog'ini yopib, kamida 30 daqiqa, yaxshisi 1 soatga qoldiring.

Jel ancha tezroq o'rnatilgan ko'rinishi mumkin, ammo DNKni jelga aylantirish juda tez orada ifloslangan diffuz chiziqlar bilan dahshatli ko'rinishga ega bo'lishi mumkin.

Jelni 2𔃃 mm chuqurlikka botirish uchun jel idishiga 0,5x TBE buferini quying. Bu ishlaydigan bufer.

Ushbu bosqichda siz jelni tayyorlash uchun xuddi shu tampondan foydalanishingiz kerak. ya'ni. Agar siz jelda 0,6xTBE ishlatgan bo'lsangiz, ishlaydigan bufer uchun 0,6xTBE dan foydalaning. Agar jel idishingiz ulardan foydalansa, metall gel hosil qiluvchilarni olib tashlashni unutmang.

Namunalarni tayyorlash

Har bir namunaning tegishli miqdorini yangi mikrofuga naychasiga o'tkazing.

Bu 10 µ L 50 µ L PCR reaktsiyasi yoki 5 µ L 20 µ L cheklash fermenti hazm bo'lishi mumkin. Agar siz 20 µL PCR reaktsiyasining to'liq 20 µL ni yuklayotgan bo'lsangiz yoki ferment hazm qilish jarayonini yuklayotgan bo'lsangiz (ko'pincha shunday qilaman), yangi naychalardan foydalanishning hojati yo'q, PCR naychalariga yuklash buferini qo'shing. Laboratoriya kitobingizga naychalarning jismoniy tartibini yozing, shunda siz jel fotosuratidagi chiziqlarni aniqlay olasiz.

Har bir trubaga mos miqdorda yuklash buferini qo'shing va uchini trubkada qoldiring.

0,2 hajmli yuklash buferini qo'shing, masalan. 10 µL namunaga 2 µL. Jelni yuklash uchun uchi yana ishlatiladi.

Men markerlarimni yuklash buferi bilan aralashtirilgan holda 4°176C haroratda saqlayman. Men 2 µL yuklashni bilaman va har bir bandda qancha DNK bor. Bu haqda ko'proq ma'lumot olish uchun pastga qarang.
Iloji bo'lsa, oxirgi quduqlardan foydalanishdan saqlaning. Misol uchun, agar sizda 12 ta namuna va 2 ta marker bo'lsa, jami 14 ta chiziqdan foydalanasiz. Agar sizning taroqingiz 18 ta quduq hosil qilgan bo'lsa, siz 4 ta quduqdan foydalanmaysiz. Tashqi quduqlardan foydalanmaslik yaxshiroqdir, chunki ular eng ko'p noto'g'ri ishlaydi.

Namunalarni yuklashni davom eting va markerning oxirgi chizig'i bilan tugating

Men jellarni o'ngdan chapga yuklayman, shunday qilib jel yo'naltirilgan bo'lib, quduqlar skameykaning chetiga yaqin bo'ladi va DNK skameykaning chetidan uzoqlashadi. Buning sababi shundaki, jellar an'anaviy tarzda nashr etiladi, go'yo quduqlar tepada joylashgan va DNK sahifani pastga tushirgan.

Jel idishini yoping, quvvat manbasini yoqing va jelni 5 V/sm tezlikda ishlating.

Misol uchun, agar elektrodlar bir-biridan 10 sm masofada joylashgan bo'lsa, jelni 50 V da ishlating. Jelni undan sekinroq ishlatish yaxshi, lekin tezroq ishlamang. 5 V/sm dan yuqori bo'lsa, agaroz qizib ketishi va eriy boshlashi mumkin, bu sizning jelingizning o'lchamlariga halokatli ta'sir qiladi. Ba'zi odamlar DNKning jelga asta-sekin va bir tekisda o'tishiga imkon berish uchun dastlab jelni sekin (masalan, 2 V/sm 10 daqiqa davomida) ishlatadilar, keyin esa jelni tezlashtiradilar. Bu yaxshiroq piksellar sonini berishi mumkin. Jellarni bir kechada juda past kuchlanishlarda ishlatish yaxshidir, masalan. 0,25𔂾,5 V/sm, agar siz allaqachon soat 11 da uyga ketmoqchi bo'lsangiz.

Oqim oqayotganligini tekshiring

Buni quvvat manbaida tekshirishingiz mumkin, milliamperlar kuchlanish bilan bir xil ball-parkda bo'lishi kerak, lekin eng yaxshi yo'l elektrodlarga qarash va ular gaz (ya'ni pufakchalar) rivojlanayotganligini tekshirishdir. Agar shunday bo'lmasa, ulanishlarni tekshiring, quvvat manbai ulanganligini va hokazo. Agar odamlar ishlaydigan bufer o'rniga suv ishlatsa, bu sodir bo'lishi ma'lum.

Marker bo'yog'iga murojaat qilib, jelning borishini kuzatib boring.

Bromofenol ko'k jel uzunligining 3/4 qismiga kirganda, jelni to'xtating.

Jel idishini o'chiring va elektr tarmog'idan uzing va jelni (agar iloji bo'lsa, ushlagichida) UV nurli qutiga qarash uchun qorong'i xonaga olib boring.

Ba'zi jel ushlagichlari UV shaffof emas, shuning uchun siz jelni yorug'lik qutisining shisha yuzasiga ehtiyotkorlik bilan qo'yishingiz kerak. UV hisoblanadi kanserogen va yalang'och teriga yoki ko'zlarga porlashiga yo'l qo'ymaslik kerak. Shuning uchun yuz himoyasi, qo'lqop va uzun ko'ylaklar taqinglar.

Yuklash buferi quduqlarga yuklashni osonlashtirish uchun namunaga rang va zichlik beradi. Bundan tashqari, bo'yoqlar neytral tamponlarda manfiy zaryadlangan va shuning uchun elektroforez paytida DNK bilan bir xil yo'nalishda harakatlanadi. Bu jelning rivojlanishini kuzatish imkonini beradi. Eng keng tarqalgan bo'yoqlar - bromofenol ko'k (Sigma B8026) va ksilen siyanoli (Sigma X4126). Zichlik glitserin yoki sukroz bilan ta'minlanadi.

Bo'yoqning aniq miqdori muhim emas
Saxarozada mog'or paydo bo'lishining oldini olish uchun 4°C haroratda saqlang. 10 ml yuklash buferi yillar davomida xizmat qiladi.

Bromofenol ko'k 200� bp DNK ga ekvivalent tezlikda migratsiya qiladi. Agar siz ushbu o'lchamga yaqin joyda bo'laklarni ko'rishni istasangiz, boshqa bo'yoqdan foydalaning, chunki bromofenol ko'k kichik bo'laklarning ko'rinishini yashiradi. Ksilen siyanoli taxminan 4kb ekvivalentda ko'chib o'tadi. Shuning uchun, agar siz 4 kb hajmdagi bo'laklarni tasavvur qilmoqchi bo'lsangiz, bundan foydalanmang.

DNK o'lchami belgilarining ko'p turlari mavjud. Qadimgi kunlarda eng arzon aniqlangan DNK bakteriofagdan edi, shuning uchun ko'plab markerlar cheklovchi fermentlar bilan kesilgan fag DNKsidir. Ularning aksariyati hali ham juda mashhur, masalan, lambda HindIII, lambda PstI, PhiX174 HaeIII. Ular o'lchamlari ma'lum bo'lgan bantlarni beradi, ammo o'lchamlar o'zboshimchalik bilan. Namuna bo'laklarida ko'rishni kutayotgan fragment o'lchami uchun yaxshi piksellar soniga ega markerni tanlang. Masalan, kichik PCR mahsulotlari uchun PhiX174 HaeIII ni tanlashingiz mumkin, lekin 6 kb fragmentlar uchun lambda HindIII ni tanlashingiz mumkin. Yaqinda kompaniyalar ma'lum oraliqlarda bantli narvon belgilarini ishlab chiqarishni boshladilar, masalan. 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 kb va boshqalar 10 kb gacha. Agar siz marker chizig'iga yuklangan DNKning umumiy miqdorini bilsangiz va barcha chiziqlar o'lchamlarini bilsangiz, jelda ko'rinadigan har bir banddagi DNK miqdorini hisoblashingiz mumkin. Bu marker chiziqlari bilan taqqoslash orqali namuna diapazonlaridagi DNK miqdorini aniqlash uchun juda foydali bo'lishi mumkin. Namunalarni yonboshlab, ikkita marker chizig'ini yuklash yaxshidir. Ko'pgina kompaniyalar DNK o'lchami belgilarini sotadilar. Eng arzonini xarid qilish foydalidir. Ko'pincha mahalliy oshxona lavabo biotexnologik kompaniyasi ajoyib markerlarni sotadi.

TBE qisqartmasi Tris Borate EDTA degan ma'noni anglatadi.

Odamlar TAE (Tris Acetate EDTA) dan ham foydalanadilar. Arzon reagentlar yordamida 10 martalik zaxira hosil qiling. Qimmat "analitik darajadagi" reagentlardan foydalanmang. Arzon Tris bazasi va borik kislotasini ommaviy sotib olish mumkin.

Ingredientlarni 1,9 L distillangan suvda eritib oling. NaOH yordamida pH ni taxminan 8,3 ga va 2 L ga yetkazing.


O'simlik to'qimalari madaniyati fanining tushunchalari va texnikasi

4.6.1 Agaroz-gel elektroforez

Agaroz gel elektroforezi DNK hajmini aniqlashning bir necha fizik usullaridan biridir. Ushbu usulda DNK elektr tokiga javoban yuqori o'zaro bog'langan agaroz matritsasi orqali ko'chib o'tishga majbur bo'ladi. Eritmada DNK fosfatlari manfiy zaryadlanadi va shuning uchun molekula musbat (qizil) qutbga o'tadi. Jel orqali migratsiya tezligiga uchta omil ta'sir qiladi: DNK hajmi, DNKning konformatsiyasi va ishlaydigan buferning ion kuchi. Agaroz elektroforezning qurilishi 4.8-rasmda keltirilgan.

4.8-rasm. Agaroz gel elektroforezi.


8.2: Agaroz jelini tayyorlang - Biologiya

Maqola xulosasi:

Agaroz gel elektroforez jarayoni DNK molekulasini ajratish va tahlil qilishning eng keng tarqalgan usuli hisoblanadi. Bu usul odatda pf biokimyo va molekulyar biologiya sohasida DNK izolyatsiyasi uchun qo'llaniladi. Ushbu texnika oqsillarni ajratish va tahlil qilishni ham qo'llab-quvvatlaydi. Kimyoviy etidiy bromid DNK molekulasini ko'rish uchun ishlatiladi. Ushbu kimyoviy moddaning xususiyati shundaki, u DNK asoslari bilan kuchli bog'lanadi va uni vizual qiladi.

Jel elektroforez jarayoni: -
DNK molekulalarini ajratish uchun gel elektroforez jarayoni quyidagi tarzda amalga oshiriladi:
1) Cheklovchi fermentlar yordamida DNK molekulasi kichik bo'laklarga yoki bo'laklarga bo'linadi.

2) Kesilgan DNK bo'laklari agaroz jeli allaqachon mavjud bo'lgan quduqlarga yoki qozonlarga ko'chiriladi.

3) Agaroz gel DNK bo'laklari bilan birga elektr toki orqali o'tkaziladi.

4) Quduq manfiy va musbat zaryadlangan elektrodlar bilan jihozlangan. Jelda elektr toki chiqarilganda manfiy elektrod manfiy zaryadlangan DNK bo'laklarini qaytaradi va ular quduqning musbat qutbiga o'tadi.

5) Ushbu usul orqali DNK bo'laklarini ularning o'lchamiga qarab ajratib olish mumkin va ularni osongina ko'rish mumkin.

Agaroz jelining qo'llanilishi: -
Agaroz jelining asosiy maqsadi cheklash fermentlari tomonidan kesilgan DNK molekulalarini ajratish va tahlil qilishdir. Ushbu kesilgan DNK bo'laklari klonlash maqsadida bitta fragmentdan turli plazmidlar hosil qilish uchun ishlatilishi mumkin. Jel elektroforezining vazifasi kesilmagan vektorlardan kesilgan plazmidlar yoki vektorlarni ajratib olishdan iborat.

Agaroz jeli RNK yoki oqsil molekulalarini jeldan ajratish uchun ham ishlatilishi mumkin. DNK fragmentlari janubiy blotdan oldin, RNK va oqsillar esa Shimoliy blotdan oldin ajratiladi. Shuningdek, u DNK fragmentlarini DNK molekulalarining turli xil nusxalarini yaratish uchun PCR orqali o'tishiga imkon beradi, shuning uchun ular DNK barmoq izini yoki boshqa har qanday usulda ishlatilishi mumkin. Bir xil o'lchamdagi DNK molekulalari agaroz jeli orqali elektr toki o'tganda ajratilishi mumkin.

DNK molekulasi hajmining miqdori va sifati lambda DNK zinapoyasi va mos ravishda bo'laklarning chiziqlari yo'qligini kuzatish orqali tahlil qilinadi. Bu shuni anglatadiki, faqat DNK bo'laklarini kuzatish yoki ajratish mumkin, ularda floresan chizig'i bor, shuning uchun ularni aniqlash mumkin.

Afzalliklari va kamchiliklari: -
Agaroz gel texnikasining asosiy afzalligi shundaki, uni osonlik bilan qayta ishlash mumkin va namuna sifatida ishlatiladigan DNK molekulasi ham jarayon oxirida unga hech qanday zarar etkazmasdan tiklanishi mumkin. Agaroz jeli DNK namunalarini denatüratsiya qilmaydi va ular o'zlarida qoladilar.

Jel elektroforezning kamchiliklari ham borki, u orqali elektr toki o'tganda erishi mumkin. Shu sababli, genetik material kerak bo'lmagan shakllarni qabul qilish imkoniyati mavjud.

Jel elektroforezidan foydalanish:
Jel elektroforezi sud tibbiyoti sohasida qo'llanilishi mumkin. DNK barmoq izini olish jarayoni agaroz gel DNK elektroforezi yordamida amalga oshirilishi mumkin.

Muallif haqida / Qo'shimcha ma'lumotlar:

Muhim Rad etish: Ushbu veb-saytdagi barcha maqolalar faqat umumiy ma'lumot uchun mo'ljallangan va professional yoki ekspert maslahati emas. Biz ushbu maqolada keltirilgan ma'lumotlarning to'g'riligi yoki haqiqiyligi yoki undan kelib chiqadigan har qanday yo'qotish yoki shikastlanish uchun javobgar emasmiz. Biz ushbu maqolalarni qo'llab-quvvatlamaymiz, biz ushbu maqolalar mualliflari bilan aloqador emasmiz va ularning mazmuni uchun javobgar emasmiz. To'liq shartlar uchun rad etish bo'limiga qarang.


Agaroz jelini qanday ishlatish kerak?

Jel matritsasi gorizontal plita sifatida quyiladi. Chiziqlar DNK yuklangan plastik taroqlar yordamida yaratiladi. Biroq, DNK yuklanishidan oldin, eritmadagi namunani tortish uchun DNKni aralashtirish uchun yuklovchi bo'yoq ishlatiladi. Bu usul ko'rinadigan markerni qoldiradi, bu DNK harakatining rivojlanishini kuzatishga yordam beradi.

Noma'lum namunalar uchun ular taqqoslash uchun DNK uzunligi ma'lum bo'lgan DNK zinapoyasi bo'ylab o'tkaziladi. Agaroz jeli o'tkazuvchan pH bilan boshqariladigan bufer eritmasi bo'lgan idishga (jel idishi / qutisiga) joylashtiriladi. Jel uzunligi bo'ylab elektr maydoni qo'llaniladi.

Voltaj gradienti jel orqali harakat tezligiga ta'sir qiladi. Elektr maydonini quvvatlantirish uchun doimiy tok manbaidan foydalaniladi. Agaroz gel elektroforezi jarayonida quvvat manbai tank hajmini hisobga olgan holda doimiy kuchlanishga o'rnatiladi. (6, 7 va 8)

Rasm 4: Qon namunasidan olingan genomik DNK agaroz gel elektroforez jarayonidan o'tdi.
Rasm manbasi:
Researchgate.net

DNKning vizualizatsiyasi

DNK jel orqali to'liq ko'chib o'tgandan so'ng, keyingi muhim qadam vizualizatsiyadir. Maqsad - berilgan namunadagi molekulalarning uzunligi va sonini tekshirish. DNK yalang'och ko'zga ko'rinmasligini hisobga olib, oson ko'rish uchun DNK bo'yalgan. Jellarni tasvirlashda lyuminestsent bo'yoq ishlatiladi, chunki u yaxshiroq aniqlash darajasini ta'minlaydi.

Agaroz jel tasviri ko'k yorug'lik transilluminatorlari bilan jihozlangan yuqori sezuvchanlik kameralari yordamida olinadi. U yorug'lik chiqarish uchun lyuminestsent dog'larni qo'zg'atish uchun ishlatiladi va keyin kamera tomonidan suratga olinadi.

Jel hujjatlarida qandaydir yorug'lik manbasi, fon yorug'ligini yo'qotadigan filtr va signalni tekshirish uchun kamera mavjud. Olingan rasm uni DNK diapazoni naqshlariga muvofiq tekshirish uchun ishlatiladi, bu DNK uzunligi va miqdorini tekshirishda foydalidir. (5, 7, 8 va 9)

5-rasm: Agaroz gel elektroforezi biologik molekulalarni ajratish uchun keng tarqalgan usullardan biridir.
Rasm manbasi:
wikimedia.org

Nima uchun agaroza jel elektroforezida agar o'rniga ishlatiladi?

Agar elektroforez paytida tez-tez ishlatiladigan moddalardan biridir. Biroq, agaroz jelidan foydalanish tobora ommalashib bormoqda. Darhaqiqat, agarga nisbatan afzalroqdir, chunki u quyish oson va kamroq zaryadlangan guruhlarga ega.

Bu har xil o'lchamdagi DNKni, ayniqsa laboratoriyada tez-tez uchraydiganlarni ajratish uchun juda mos keladi. Ajratilgan DNKni bo'yash va ultrabinafsha nurlar kabi to'g'ri yoritish yordamida osongina ko'rish mumkin.

Ekstraksiya jarayoni ham nisbatan oson. Odatda ishlatiladigan agaroz jeli 0,7% dan 2% gacha va elektroforez buferida eritiladi. (2, 4 va 7)


Videoni tomosha qiling: Gel elektroforez. Biotexnologiya. Biologiya (Iyul 2022).


Izohlar:

  1. Coltere

    Shunisi e'tiborga loyiqki, bu juda qimmatli iboradir

  2. Fiacra

    I have a similar situation. Forum taklifnomasi.

  3. Ainsley

    I deleted this question

  4. Gazuru

    Bu ajoyib g'oya foydali bo'ladi.



Xabar yozing